周露丹 范海玲 王麗珍 梁國(guó)安

臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）臺(tái)州醫(yī)院兒內(nèi)科，浙江臨海 317000

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE），又稱新生兒缺氧缺血性腦病，主要是指圍生期新生兒由各種因素導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損傷綜合征。新生兒缺氧缺血性腦損傷可以誘發(fā)臨床新生兒的早期死亡、智能障礙、腦性癱瘓者和癲癇等不同程度的腦損傷綜合征，可以造成兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重的損害[1，2]。所以如何改善預(yù)后，提高兒童生存質(zhì)量，已引起了各國(guó)政府和學(xué)者的高度重視。目前國(guó)內(nèi)臨床多采用維持腦內(nèi)能量代謝平衡、促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌和抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等藥物治療結(jié)合高壓氧、亞低溫等綜合治療方案，并強(qiáng)調(diào)早期干預(yù)的重要性[3，4]。然而，這些藥物雖達(dá)到了一定治療HIE的效果，但當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元大面積損傷時(shí)，神經(jīng)元的再生與突觸聯(lián)系明顯減弱，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能難以修復(fù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD34+造血細(xì)胞可以用來(lái)治療新生兒缺氧缺血性腦病，但限于CD34+造血細(xì)胞數(shù)量限制，不能廣泛應(yīng)用[5，6]。本研究基于目前最新研究成果，以臍帶血為研究對(duì)象，建立體外人造血干細(xì)胞（CD34+）增殖模型，篩選出能夠在體外未分化狀態(tài)下促進(jìn)其擴(kuò)增的新型小分子，以期最終獲得一系列對(duì)體外擴(kuò)增人CD34+造血干細(xì)胞行之有效的化合物，探討臍血CD34+干細(xì)胞治療新生兒缺氧缺血性腦病的效果和機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供可行性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 擴(kuò)增CD34+造血干細(xì)胞的化合物篩選與鑒定

采用密度梯度離心法結(jié)合免疫磁珠分選法獲得單個(gè)核細(xì)胞，再采取MACS技術(shù)分離得CD34+造血干細(xì)胞，用FACScan檢測(cè)CD34+比例，加入合成的化合物，進(jìn)行體外培養(yǎng)14 d，繼續(xù)用FACScan檢測(cè)增殖水平。選取擴(kuò)增倍數(shù)高、分化低的化合物SR1處理后的CD34+造血干細(xì)胞的培養(yǎng)，采用FACScan檢測(cè)培養(yǎng)后細(xì)胞生物學(xué)表型變化情況，然后與缺血缺氧后的神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞增殖、遷移等方面的能力。

1.2 新生鼠缺氧缺血性腦病模型的建立

選取90只7日齡SD大鼠構(gòu)建大鼠缺氧缺血?jiǎng)游锬Ｐ筒㈦S機(jī)分為三組（每組30只）：對(duì)照組、模型組和治療組。通過(guò)改良后的Rice法建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型。用6%水合氯醛腹腔麻醉新生SD大鼠（5 mL/kg），頸正中切口，結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，造成缺血。術(shù)后約恢復(fù)2 h將新生SD大鼠置于恒溫密閉的缺氧箱中，并給予持續(xù)2 h通入 8%O2+92%N2的混合氣體（氣流量2 L/min），構(gòu)建新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型。對(duì)照組給予新生SD大鼠頸總動(dòng)脈分離，但不結(jié)扎，直接縫合切口并不給予缺氧處理。治療組術(shù)后第5天行CD34+細(xì)胞移植，移植細(xì)胞數(shù)量為5×105cells/kg，選用左側(cè)腋中線及第二乳頭水平線交界點(diǎn)向上平移2 mm作為穿刺點(diǎn)，于吸氣相向下向左傾斜60°進(jìn)針約5 mm，回抽血液順利，可緩慢、間歇性注入CD34+細(xì)胞。模型組大鼠經(jīng)左心室注射等量的生理鹽水作為對(duì)照。

1.3 HE染色和TUNEL原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)

大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，留取腦組織常規(guī)脫水、透明及石蠟包埋，切片（5 μm/張）。常規(guī)進(jìn)行蘇木精和伊紅液染色，觀察腦組織切片HE染色結(jié)果。其余切片按照TUNEL凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測(cè)。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者即為凋亡細(xì)胞，選擇6個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)平均值。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BDNF和NGF蛋白表達(dá)

取大鼠腦組織石蠟切片標(biāo)本，室溫封閉40 min（5%血清），加入單克隆抗體BDNF和NGF，堿性磷酸酶二抗4℃孵育。PBS清洗后加入SP，DAB恒溫顯色封片。用10×、40×物鏡顯微鏡進(jìn)行觀察。BDNF和NGF的主要陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)：棕黃色顆粒在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)。計(jì)算乳腺癌組織中BDNF和NGF蛋白表達(dá)的平均光密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臍血CD34+細(xì)胞的檢測(cè)

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所得的臍血CD34+干細(xì)胞，結(jié)果顯示CD34+干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD34的表達(dá)有明顯上升，從擴(kuò)增前2.9%升高到擴(kuò)增后99.2%，見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所得的臍血CD34+干細(xì)胞

2.2 動(dòng)物造模行為學(xué)表現(xiàn)

對(duì)照組新生大鼠動(dòng)作正常、反應(yīng)靈敏且呼吸規(guī)律，未見(jiàn)行為學(xué)的異常表現(xiàn)。模型組新生大鼠5～10 min出現(xiàn)明顯的煩躁不安、呼吸加快加深；30 min逐漸出現(xiàn)四肢抖動(dòng)、站立不穩(wěn)、翻滾、肌肉顫動(dòng)、夾尾左旋；1 h后大鼠的自主活動(dòng)明顯減少，皮膚發(fā)紺出現(xiàn)紫癜，反應(yīng)差處于精神抑制狀態(tài)，出現(xiàn)自發(fā)的左旋或夾尾左旋；眼睛延遲張眼，眼裂較小，上瞼下垂。治療組大鼠給予CD34+干細(xì)胞移植后，上述癥狀減輕，動(dòng)物吸吮能力和精神狀態(tài)恢復(fù)，四肢活動(dòng)逐漸增多協(xié)調(diào)。

2.3 HE染色結(jié)果

對(duì)照組：神經(jīng)細(xì)胞層次清晰，排列緊密整齊，細(xì)胞形態(tài)正常完整，結(jié)構(gòu)清晰。神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞胞漿豐富，胞核和核仁清楚居中。模型組：術(shù)后12～48 h出現(xiàn)明顯的細(xì)胞腫脹，形態(tài)結(jié)構(gòu)不清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增寬增大；空泡變性神經(jīng)元增多，胞體皺縮溶解，胞質(zhì)深染核固縮；72 h出現(xiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞片狀壞死，形成疏松空網(wǎng)狀空洞；大量炎性細(xì)胞和胞漿嗜伊紅樣細(xì)胞浸潤(rùn)，有大量膠質(zhì)細(xì)胞增生。治療組：與相同時(shí)間點(diǎn)模型組相比，神經(jīng)細(xì)胞損傷程度明顯減輕，細(xì)胞排列尚且規(guī)則，多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰正常，少量神經(jīng)細(xì)胞變性壞死且存活數(shù)量較多，炎性細(xì)胞和嗜伊紅樣細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見(jiàn)圖2。

圖2 HE染色結(jié)果（200×）

2.4 TUNEL染色結(jié)果

對(duì)照組：僅有少量凋亡陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞散在分布，細(xì)胞核著色淡。模型組：神經(jīng)細(xì)胞陽(yáng)性凋亡明顯增多，呈片狀分布，細(xì)胞核內(nèi)有棕褐色顆粒沉積，細(xì)胞體積縮小、形態(tài)不規(guī)則。治療組：陽(yáng)性神經(jīng)元凋亡細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞核染色稍淺。與對(duì)照組大鼠腦組織內(nèi)凋亡神經(jīng)元數(shù)量（14.37±2.35）相比，模型組大鼠腦組織內(nèi)凋亡神經(jīng)元數(shù)量（54.62±6.38）和治療組大鼠腦組織內(nèi)凋亡神經(jīng)元數(shù)量（33.19±4.23）顯著上升，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。與模型組相比，治療組大鼠腦組織內(nèi)凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯降低，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05） ，見(jiàn)圖 3。

圖3 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果（200×）

2.5 免疫組化染色結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組和治療組大鼠腦組織內(nèi)BDNF和NGF含量顯著下降，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；與模型組相比，治療組大鼠腦組織內(nèi)BDNF和NGF含量明顯上升，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見(jiàn)圖4和表1。

圖4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（400×）

表 1 免疫組化蛋白表達(dá)含量結(jié)果（x±s，n＝30）

3 討論

近年來(lái)，隨著不斷深入研究神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和造血干細(xì)胞等干細(xì)胞移植，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血、變性及損傷性疾病中可發(fā)揮顯著的神經(jīng)再生、修復(fù)和功能重建作用，為治療此類疾病帶來(lái)了新的希望[7，8]。然而，由于胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的安全性受到質(zhì)疑、來(lái)源困難及法律、倫理學(xué)問(wèn)題等原因，其進(jìn)一步臨床應(yīng)用受到很大限制。相比之下，造血干細(xì)胞移植具備以下優(yōu)勢(shì)：①采集方便，給患者帶來(lái)的損傷小；②來(lái)源豐富；③免疫排斥概率相對(duì)小、安全性好；④可自體移植，基本不涉及倫理問(wèn)題；⑤適宜條件下能向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化；⑥能在腦組織中成活、遷移和分化[9，10]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者已通過(guò)如密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法、磁珠分離法和細(xì)胞貼壁篩選法等各種分離培養(yǎng)方法培養(yǎng)出CD34+造血干細(xì)胞，并且把培養(yǎng)出的CD34+造血干細(xì)胞分化為多種組織細(xì)胞，如脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱和韌帶、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、表皮細(xì)胞，用于多種疾病自體化治療[11，12]。CD34+造血干細(xì)胞移植可以有效增強(qiáng)局部缺血大腦的神經(jīng)可塑性效應(yīng)，促進(jìn)新血管的生成，增加局部缺血部位的皮質(zhì)血供，參與神經(jīng)組織的修復(fù)等[13，14]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的煩躁不安、四肢抖動(dòng)、站立不穩(wěn)、夾尾左旋、眼睛延遲張眼、眼裂較小等神經(jīng)和精神抑制癥狀。給予大鼠CD34+干細(xì)胞移植后，上述行為和精神癥狀減輕，動(dòng)物四肢活動(dòng)和精神狀態(tài)明顯改善，說(shuō)明CD34+干細(xì)胞移植可以通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化、增殖和改善大腦內(nèi)的缺血缺氧癥狀來(lái)有效緩解大鼠的神經(jīng)和精神障礙體征。同時(shí)，本研究HE染色和TUNEL凋亡染色結(jié)果表明，給予缺血缺氧新生大鼠CD34+干細(xì)胞移植后，可以有效減少缺血缺氧新生大鼠體內(nèi)神經(jīng)元的損傷和凋亡發(fā)生，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的再生，產(chǎn)生顯著的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，有效緩解神經(jīng)元損傷。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）屬于神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)因子家族，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在大腦海馬和皮質(zhì)內(nèi)的含量最高[15]。BDNF可具有維持和促進(jìn)5-羥色胺（5-HT）和多巴胺（DA）能神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化，增加神經(jīng)突觸的生理可塑性，修復(fù)受損神經(jīng)元，改善患者學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知的功能作用[16，17]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）是一種可以調(diào)節(jié)周圍和中樞神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，主要維持神經(jīng)元的生存和存活、營(yíng)養(yǎng)及促突起生長(zhǎng)，能顯著調(diào)控中樞及周圍神經(jīng)元的分化、發(fā)育和再生，促進(jìn)神經(jīng)元生理功能的特性表達(dá)，NGF具有促進(jìn)再生神經(jīng)功能恢復(fù)的作用[18-20]。本研究結(jié)果表明，給予缺血缺氧新生大鼠CD34+干細(xì)胞移植后，可有效增加促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子的含量表達(dá)，說(shuō)明CD34+干細(xì)胞移植可以促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和再生，改善神經(jīng)損傷的過(guò)程，維持神經(jīng)元的生存和存活、營(yíng)養(yǎng)，調(diào)控神經(jīng)元的功能，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，CD34+造血干細(xì)胞移植可改善腦內(nèi)微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生，促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等的表達(dá)，恢復(fù)損傷的神經(jīng)功能。但CD34+造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力是否可控、是否產(chǎn)生致瘤性等都是目前研究尚沒(méi)有解決的問(wèn)題，仍需要臨床進(jìn)一步研究。

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