程招弟 劉清華

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西省大同市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山西大同 037000

帕金森病是繼阿爾茨海默病后第二位常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，主要的病理學(xué)特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元不可逆的丟失和路易小體的形成。至今所有的治療手段都僅限于控制癥狀，不能阻止或延緩多巴胺能神經(jīng)元的退行性改變[1,2]。5－羥色胺（5-HT）由腸道中的腸嗜鉻細(xì)胞合成，其受體在腦中分布廣泛，張淑靜等[3]及Lindenbach D等[4]均研究證實(shí)，5-HT微量注射可以增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性，緩解PD的行為異常，Nicholson SL等[5]研究結(jié)果顯示，5-HT受體與PD的治療密切相關(guān)。但5-HT無(wú)法透過(guò)血腦屏障，腦中的5-HT幾乎完全來(lái)源于中縫核的神經(jīng)細(xì)胞所分泌，此產(chǎn)生量有限。所以，尋求一種外源性可以激活黑質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT受體的藥物非常重要。

艾司西酞普蘭是一個(gè)高選擇性5-HT受體再攝取抑制劑，可以通過(guò)血腦屏障，主要被用來(lái)治療抑郁癥，王燕娟等[6]在艾司西酞普蘭對(duì)AD的研究中發(fā)現(xiàn)，艾司西酞普蘭可促進(jìn)受損腦區(qū)神經(jīng)元的增生、遷移，支持新生神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育，同時(shí)具有抗炎、抑制tua蛋白的形成，從而延緩AD的進(jìn)展。張建斌等[7]對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷模型進(jìn)一步研究顯示，草酸艾司西酞普蘭可以明顯減輕腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)損傷和改善神經(jīng)功能，具有神經(jīng)保護(hù)作用。在帕金森病模型中尚未有研究，推測(cè)其在帕金森病小鼠模型中同樣具有神經(jīng)保護(hù)作用，為帕金森病的治療提供可能的思路。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

40只8周齡的SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠（SCXC-2014-004），動(dòng)物房溫度維持在20℃～22℃，濕度 30%，小鼠保持12 h晝夜節(jié)律，自由飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

MPTP 購(gòu)于 Sigma公司，兔抗鼠 TH、BDNF、IL-1β一抗及BSA試劑盒、BCA封閉液、ECL化學(xué)發(fā)光液、二抗等均購(gòu)于博士德公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

疲勞式轉(zhuǎn)棒儀購(gòu)于山東科技有限公司；采用萊卡自動(dòng)組織脫水機(jī)；BIO-RAD的電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀；美國(guó)Themro酶標(biāo)儀；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備 將小鼠隨機(jī)分為4個(gè)組：生理鹽水組 [0.9%NaCl 0.2 mL/（只·d）ip]；MPTP模型組[MPTP 25 mg/（kg·d） ip]；艾司西酞普蘭組[艾司西酞普蘭 10mg/（kg·d） ip]；治療組[MPTP 25 mg/（kg·d），半小時(shí)后注射艾司西酞普蘭 10 mg/（kg·d）]。 所有的注射均開(kāi)始于每天清晨8時(shí)，連續(xù)注射7 d。

1.4.2 行為學(xué)檢測(cè) 滾輪實(shí)驗(yàn)：滾輪實(shí)驗(yàn)主要用于檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)平衡能力，設(shè)置轉(zhuǎn)速為 20 r/min，時(shí)間為3 min，適應(yīng) 3次后，將小鼠放于靜止的轉(zhuǎn)軸上，啟動(dòng)轉(zhuǎn)棒儀并開(kāi)始計(jì)時(shí)，從轉(zhuǎn)軸開(kāi)始轉(zhuǎn)動(dòng)到小鼠掉落計(jì)為總時(shí)間。

1.4.3 免疫組化 每組選取6只小鼠用4%的多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，切取中腦腦組織，進(jìn)行梯度脫水，石蠟包埋。黑質(zhì)區(qū)連續(xù)冠狀切片，片厚設(shè)置為 5 μm，脫蠟，高壓抗原修復(fù)，滴加抗體TH（1:200），4℃孵育過(guò)夜，后進(jìn)行二抗孵育，37℃，30 min。DAB顯色，蘇木素浸染1～2 min，鹽酸酒精分化2 s，流水沖洗返藍(lán)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，甘油封片。使用Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng),在放大200倍視野下，分別隨機(jī)選取黑質(zhì)區(qū)6張非重疊區(qū)域的腦片進(jìn)行拍攝，后采用Image，Proplus圖像分析軟件進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，外側(cè)部和腹內(nèi)側(cè)部隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，取平均值。

1.4.4 Western blot每組剩余的4只小鼠采用頸椎脫臼法處死小鼠，開(kāi)顱取腦留中腦部分用于Western blot檢測(cè)，組織剪碎后加入RIPA裂解組織，4℃離心，取上清，蛋白濃度測(cè)定。計(jì)算上樣量，配制等濃度、等體積蛋白液，金屬浴100℃煮蛋白（10 min），冷卻后電泳。電泳完成后半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，設(shè)置電流為膜面積×2.5 mA，恒流轉(zhuǎn)膜30～45 min。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加一抗BDNF、IL-1β于4℃冰箱搖床孵育過(guò)夜。次日，二抗室溫?fù)u床孵育2 h。將ECL顯色液1:1混合后，反應(yīng)1 min后放入顯像儀中顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布的多組間比較采用單因素方差分析。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)取ɑ=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為檢測(cè)

小鼠在3 min滾輪實(shí)驗(yàn)中記錄到的第一次掉落的時(shí)間，并重復(fù)三次的平均值。腹腔注射MPTP后，小鼠在滾輪上的時(shí)間明顯減少（49.5±19.2）s，與對(duì)照組相比差異顯著（P=0.000），單純注射艾司西酞普蘭組與對(duì)照組相比無(wú)差異，艾司西酞普蘭治療組與MPTP組相比，時(shí)間延長(zhǎng)至（91.0±16.4）s （P=0.000）。說(shuō)明艾司西酞普蘭可以部分逆轉(zhuǎn)MPTP所造成的C57小鼠平衡能力的缺損（圖1）。

圖1 滾輪實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 免疫組化檢測(cè)黑質(zhì)致密部區(qū)TH的表達(dá)

2.2.1 TH的表達(dá) 生理鹽水對(duì)照組，黑質(zhì)區(qū)見(jiàn)大量TH陽(yáng)性表達(dá)，腹腔注射MPTP后，黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異顯著（57±18.12）（P=0.001）。 注射艾司西酞普蘭后TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于MPTP組（73.2±14.85）（P=0.016），說(shuō)明艾司西酞普蘭可以增加黑質(zhì)區(qū)TH的表達(dá)（圖2）。

圖2 黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性表達(dá)免疫組化染色及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.2.2 Westernblot檢測(cè)BDNF、IL-1β的表達(dá) Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，經(jīng)Image lab軟件掃描處理并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，MPTP組黑質(zhì)區(qū)的BDNF的表達(dá)顯著降低，同時(shí)IL-1β的表達(dá)顯著升高。而與MPTP組相比，艾司西酞普蘭組BDNF的表達(dá)顯著增高，IL-1β的表達(dá)顯著降低，該結(jié)果表明，在 MPTP誘導(dǎo)的PD模型，應(yīng)用艾司西酞普蘭可通過(guò)上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、下調(diào)IL-1β炎性因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

圖3 中腦IL-1β及BDNF表達(dá)Western blot及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

3 討論

目前帕金森病的治療主要以補(bǔ)充外源性多巴胺為主要手段，但副作用大，且不能延緩黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元退行性變，故尋求新的具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物尤為重要。MPTP是目前公認(rèn)的制備帕金森病小鼠模型的藥物[8]，本實(shí)驗(yàn)采用MPTP腹腔注射制備C57小鼠PD模型，具有明顯的行為學(xué)改變，免疫組化結(jié)果顯示，MPTP注射后，黑質(zhì)區(qū)TH的表達(dá)下調(diào)明顯，說(shuō)明MPTP可造成多巴胺能神經(jīng)元缺失，并且Western blot結(jié)果顯示，黑質(zhì)區(qū)IL-1β的含量增多，分析MPTP造成的多巴胺能神經(jīng)元的損傷與炎癥反應(yīng)增多有關(guān)。

以往研究表明，增加5-HT的表達(dá)，可以改善帕金森病的癥狀[9-11]。腦內(nèi)微量注射5-羥色胺可以增加神經(jīng)元興奮性，緩解PD的行為異常[12]。并且5-HT受體在腦內(nèi)廣泛分布，其中 5-HT1A、5-HT1B及5-HT2C受體與PD的發(fā)病及治療具有相關(guān)性[13]，但由于腦部合成量少，又難通過(guò)血腦屏障，故應(yīng)用受限。

本實(shí)驗(yàn)研究的艾司西酞普蘭是一個(gè)高選擇性5-HT受體再攝取抑制劑，可以通過(guò)血腦屏障，具有神經(jīng)保護(hù)作用。王燕娟等[6]在艾司西酞普蘭對(duì)AD的研究中發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默病的動(dòng)物中，SSRI可促進(jìn)神經(jīng)元的增生，支持新生神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育，并且研究發(fā)現(xiàn)可以促神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)。本次實(shí)驗(yàn)中，艾司西酞普蘭治療組與MPTP模型組相比，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF的表達(dá)上調(diào)明顯，與以往研究結(jié)果相一致，說(shuō)明艾司西酞普蘭具有促神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌的功能。

BDNF是NGF家族的一種，可以增加紋狀體GABA神經(jīng)元的存活，并且可以調(diào)節(jié)突觸活性和神經(jīng)遞質(zhì)的合成，其減少可導(dǎo)致PD的發(fā)病[14]。給予外源性BDNF可以改善阿爾茨海默病及帕金森病的臨床癥狀。本研究結(jié)果顯示，艾司西酞普蘭可促進(jìn)BDNF分泌，為PD的治療提供了一個(gè)新的可能。

Avraham SL等[15]的研究顯示，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中草酸艾司西酞普蘭可以明顯減輕腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)損傷和改善神經(jīng)功能，且藥物干預(yù)的效果隨著時(shí)間的推移而逐步增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在滾輪實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)艾司西酞普蘭治療后，小鼠在滾輪上停留的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明給予艾司西酞普蘭腹腔注射后可以部分逆轉(zhuǎn)由MPTP所致的PD小鼠的行為異常。黑質(zhì)區(qū)TH免疫組化染色顯示，與MPTP模型組相比，艾司西酞普蘭組上調(diào)TH的表達(dá)，TH是合成多巴胺的關(guān)鍵的限速酶，說(shuō)明艾司西酞普蘭通過(guò)促進(jìn)TH的表達(dá)從而進(jìn)一步促進(jìn)多巴胺的合成。此外，本次研究結(jié)果顯示艾司西酞普蘭可以下調(diào)促炎因子IL-1β的表達(dá)，說(shuō)明其具有抗炎作用。

綜上所述，艾司西酞普蘭對(duì)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用是通過(guò)抑制炎癥、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)因子分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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（收稿日期：2017-11-17）