楊文 于旭東 蔡澤坪 羅佳佳 孟帥良

摘 要 為探究接觸刺激與2，4表油菜素內(nèi)酯（2，4-Epibrassinolide，2，4-eBL）誘導(dǎo)的水稻（Oryza sativa L.）根不對稱生長之間的關(guān)系，本研究采用懸吊培養(yǎng)法和根冠蘸蠟法模擬接觸刺激的有無。結(jié)果表明：僅有2，4-eBL或接觸刺激存在時，水稻根不對稱生長比例較低，不超過9.7%；而當(dāng)2，4-eBL和接觸刺激同時存在時，水稻根不對稱生長比例高達(dá)90.7%。采用根冠蘸蠟法模擬接觸刺激也得到類似結(jié)果。本文研究外源施加2，4-eBL誘導(dǎo)水稻根不對稱生長的現(xiàn)象及在此過程中接觸刺激發(fā)揮的關(guān)鍵作用，為探究油菜素類固醇（Brassinosteroids，BRs）與接觸刺激之間的關(guān)系提供新見解。

關(guān)鍵詞 接觸刺激；油菜素類固醇；水稻；根；不對稱生長

中圖分類號 S59 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract To investigate the relationship between contact stimuli and asymmetric growth of rice （Oryza sativa L.） roots induced by 2，4-Epibrassinolide（2，4-eBL）， the suspension culture method and the root cap dipping wax method were used to simulate the presence or absence of contact stimulation. When only 2，4-eBL or contact stimuli were found， the proportion of asymmetric growth of rice roots was low， not more than 9.7%. When 2，4-eBL and contact stimuli were present at the same time， the ratio of asymmetric growth of rice root was as high as 90.7%. Simulations of contact stimuli using the root cap dipping method have also yielded similar results. This article describes the phenomenon of asymmetric growth of rice roots induced by external application of 2，4-eBL and the key role of contact stimuli in this process， providing new insights into the relationship between brassinosteroids （BRs） and contact stimuli.

Keywords contact stimuli； brassinosteroids； rice； root； asymmetric growth

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.003

油菜素類固醇（Brassinosteroids，BRs）是廣泛存在于植物中的結(jié)構(gòu)類似于動物固醇類激素的一種天然產(chǎn)物[1]。目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近70種BRs，在這些具有生物活性的BRs中，油菜素內(nèi)酯（Brassinolide， BL）的活性最高[2-3]。BRs在植物體各器官中的分布不均勻，尤其在根中的含量甚微，反之，根對BRs的反應(yīng)要比植物體的其他部位敏感得多[4]。微量的BRs就能影響根的生長，在水稻中低濃度的BL（≤10 nmol/L）促進(jìn)根生長，高濃度的BL（>100 nmol/L）則抑制根生長[5-6]。此外，BL還能調(diào)控側(cè)根與不定根的形成，在擬南芥中低濃度的BL（≤10 nmol/L）促進(jìn)側(cè)根和不定根的形成，高濃度的BL（>100 nmol/L）則起到抑制作用[7]。

根具有復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能感知和響應(yīng)不同的環(huán)境信號，如重力和接觸刺激[8]。其中重力能調(diào)節(jié)根系向著地心引力的方向生長[9]，而接觸刺激能抑制根的向地性[10]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)擬南芥在傾斜的瓊脂塊上生長根會發(fā)生波浪形彎曲，但在解釋這一現(xiàn)象時并沒有考慮到瓊脂塊對根生長的接觸刺激作用[11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)2.5 mg/L乙烯（Ethylene）能誘導(dǎo)番茄根發(fā)生卷曲[12]。0.5 μmol/L茉莉酸（Jasmonic acid）也能誘導(dǎo)10%～15%水稻根發(fā)生卷曲[13]。但上述根不對稱生長與根尖接觸刺激是否有關(guān)尚不清楚。本研究以根尖接觸刺激的有無為切入點(diǎn)，通過根冠蘸蠟法模擬根尖接觸刺激，研究根尖接觸刺激在外源施加2，4表油菜素內(nèi)酯（2，4-Epibrassinolide，2，4-eBL）誘導(dǎo)水稻根不對稱生長中的關(guān)鍵作用，為探究接觸刺激與根不對稱生長之間的關(guān)系提供新見解。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻種子為“準(zhǔn)兩優(yōu)2號”，由國家雜交水稻研究中心清華深圳龍崗研究所用準(zhǔn)SxR402 雜交選配選育而成。2，4-eBL（code E-1641）購自Sigma公司，用75%乙醇溶解并配置成1 mmol/L母液。

1.2 方法

1.2.1 水稻種子滅菌及催芽 挑選穎殼不開裂且飽滿的種粒500顆，置于培養(yǎng)皿中，用75%乙醇滅菌1 min后，自來水沖洗8～12遍，置于培養(yǎng)皿中并加入少量自來水，在培養(yǎng)間催芽2 d，挑選長勢一致的水稻幼苗用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 懸吊培養(yǎng)法 分別配制自來水、2×10–8 mol/L 2，4-eBL水溶液作為水稻培養(yǎng)液，在培養(yǎng)皿（? 150 mm）、燒杯（1 000 mL）中分別加入200、700 mL。將挑選好的水稻種子用玻璃膠整齊地粘于竹簽上，將粘好水稻種子的竹簽水平地置于培養(yǎng)皿、燒杯上，并使根尖半浸入培養(yǎng)液中。其中在培養(yǎng)皿中懸吊培養(yǎng)的水稻作2個處理：培養(yǎng)2 d使根尖不接觸培養(yǎng)皿底部（處理1），培養(yǎng)3 d使根尖生長接觸培養(yǎng)皿底部（處理2）。在燒杯中懸吊培養(yǎng)的水稻作2個處理：培養(yǎng)4 d使根尖不接觸燒杯底部（處理3），培養(yǎng)4 d并采用根冠蘸蠟法模擬接觸刺激（處理4）。以上每個處理均設(shè)立5次重復(fù)。

1.2.3 根冠蘸蠟法 將融化的蠟液滴在載玻片上，待蠟液即將凝固（約55 ℃）時將其快速蘸在水稻根冠上，將根冠蘸有蠟塊的水稻幼苗迅速放回培養(yǎng)液中進(jìn)行懸吊培養(yǎng)。

1.2.4 培養(yǎng)條件 溫度（24±2）℃，光強(qiáng)1 000 lx， 光照16 h/d，黑暗8 h/d。調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH=7.0，每組均接入30棵水稻幼苗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

水稻初生根的不對稱生長比例=根發(fā)生不對稱生長的水稻幼苗數(shù)/水稻幼苗總數(shù)。采用LSD法進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)波浪形彎曲（wave）和卷曲（coiling）同時存在時作coiling計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 接觸刺激對水稻根不對稱生長的影響

結(jié)果表明，水稻初生根在2，4-eBL中只有接觸培養(yǎng)皿底部時才會發(fā)生不對稱生長。根不對稱生長的類型可概括為2種模式：①wave：根呈正弦式彎曲生長，波峰、波谷交替連續(xù)出現(xiàn)3次以上（圖1-E）；②coiling：根繞中心軸連續(xù)旋轉(zhuǎn)一圈以上（圖1-D）。wave與coiling卷曲可同時出現(xiàn)于同一根中（圖1-F）。

將水稻幼苗在自來水中進(jìn)行懸吊培養(yǎng)，2 d后根尖未接觸培養(yǎng)皿底部時，水稻初生根直立向下生長，即在2，4-eBL與接觸刺激均不存在時，水稻初生根正常生長的比例為100%，不發(fā)生不對稱生長。而當(dāng)3 d后根尖接觸培養(yǎng)皿底部時，在自來水條件下培養(yǎng)的水稻初生根發(fā)生輕微的不對稱生長。即在僅有接觸刺激無2，4-eBL的條件下，水稻初生根發(fā)生wave的比例為9.7%，不發(fā)生coiling，總不對稱生長比例為9.7%（表1和圖1-A）。

將水稻幼苗在2×10–8 mol/L 2，4-eBL中進(jìn)行懸吊培養(yǎng)，2 d后根尖未接觸培養(yǎng)皿底部時，水稻初生根發(fā)生低比例的不對稱生長。即在僅有2，4-eBL無接觸刺激的條件下，水稻初生根發(fā)生wave的比例為4.9%，無coiling，總不對稱生長比例為4.9%。而當(dāng)3 d后根尖接觸培養(yǎng)皿底部時，在2×10–8 mol/L 2，4-eBL和接觸刺激同時存在的條件下，水稻初生根不對稱生長比例大幅提高，wave和coiling的比例分別為16.5%和74.2%，總不對稱生長比例上升到90.7%（表1和圖1-B）。

綜上所述，在2，4-eBL和接觸刺激均存在的情況下，coiling才能發(fā)生，且在此情況下wave和總不對稱生長的比例大幅提高，分別為僅有接觸刺激條件的1.7、9.4倍，僅有2，4-eBL條件的3.4、18.5倍。

2.2 根冠蘸蠟法模擬接觸對水稻根不對稱生長的影響

將水稻幼苗在自來水中進(jìn)行懸吊培養(yǎng)，4 d后根尖未接觸燒杯底部時，水稻初生根正常生長。

即接觸刺激與2，4-eBL均不存在時，wave和coiling的比例均為0，總不對稱生長比例為0（表2和圖2-A）。而當(dāng)根冠蘸蠟的水稻初生根在自來水中培養(yǎng)懸吊培養(yǎng)4 d后，水稻初生根不對稱生長情況與水稻在自來水中接觸培養(yǎng)皿底部時的不對稱生長情況類似。即在只有接觸刺激的條件下，水稻初生根僅發(fā)生輕微的wave比例為8.6%，不發(fā)生coiling，總不對稱生長比例為8.6%（表2和圖2-C）。

將水稻幼苗在2×108 mol/L 2，4-eBL中進(jìn)行懸吊培養(yǎng)，4d后根尖未接觸燒杯底部時，水稻初生根發(fā)生低比例的不對稱生長。即在只有2，4-eBL無接觸刺激的條件下，發(fā)生wave的比例為6.5%，不發(fā)生coiling，總不對稱生長比例為6.5%（表2和圖2-B）。而當(dāng)根冠蘸蠟的水稻初生根在2×108 mol/L 2，4-eBL溶液中培養(yǎng)懸吊培養(yǎng)4 d后，水稻初生根的不對稱生長情況與水稻在2，4-eBL中接觸培養(yǎng)皿底部時的不對稱生長情況相似。即在接觸刺激和2，4-eBL同時存在的條件下，水稻初生根發(fā)生高比例的不對稱生長，wave和coiling的比例分別為36.7%和28.5%，總不對稱生長比例為65.2%（表2和圖2-D）。

綜上所述，在2，4-eBL和根冠蘸蠟均存在的情況下coiling才發(fā)生，且在此情況下wave和總不對稱生長比例大幅提高，分別為僅有根冠蘸蠟條件的4.3和7.6倍，僅有2，4-eBL條件的5.6和10.0倍。

從圖3可看出，在wave和coiling兩種不對稱生長模式中包含著許多不對稱生長情況。如逆時針卷曲、逆時針后順時針卷曲、順時針后逆時針卷曲、無規(guī)則卷曲、一大一小卷曲、根繞根卷曲等。當(dāng)水稻根尖接觸培養(yǎng)皿底部時，2，4-eBL不僅能誘導(dǎo)初生根不對稱生長，還能誘導(dǎo)之后生出的所有不定根也發(fā)生不對稱生長（圖3-I）。說明2，4-eBL對所有的水稻根作用效果相同。

3 討論

本研究結(jié)果表明，2，4-eBL能誘導(dǎo)水稻初生根不對稱生長發(fā)生wave和coiling，但此過程還需要接觸刺激的參與。如果水稻根尖未受到接觸刺激，即使在2，4-eBL條件下水稻初生根不對稱生長的比例仍較低。這說明接觸刺激在根的不對稱生長過程中起著關(guān)鍵作用。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，采用根冠蘸蠟法模擬接觸刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在自來水條件下僅少量根發(fā)生wave，無coiling，而在2，4-eBL條件下，大部分根發(fā)生不對稱生長形成wave和coiling。

在本研究中，采用根冠蘸蠟的方法模擬接觸刺激，在蘸蠟過程中要注意蠟塊只需適量接觸到水稻根冠即可，如果過量接觸到分生區(qū)或伸長區(qū)則會影響根的生長。同時，還需注意蘸蠟時蠟塊的溫度應(yīng)控制在54～57 ℃，因?yàn)檫^高的溫度會導(dǎo)致根活力下降，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[14]。此外，根冠蘸蠟是保持根尖接觸刺激的一種溫和的實(shí)驗(yàn)方法，所以在根生長過程中會有一部分蠟塊脫落，導(dǎo)致根冠蘸蠟誘導(dǎo)的根不對稱生長比例小于接觸瓶底誘導(dǎo)的根不對稱生長比例。

在自來水中水稻根尖接觸瓶底/根冠蘸蠟后，初生根會發(fā)生一定程度的彎曲，但這種彎曲是水稻根尖遇到障礙物后的自然現(xiàn)象[15]。而2，4-eBL誘導(dǎo)的wave和coiling是根有規(guī)律的不對稱生長，兩者在形態(tài)上有很大區(qū)別，易于區(qū)分。

在自來水中水稻根尖接觸瓶底或根冠蘸蠟后，初生根會發(fā)生低比例的wave。對于此現(xiàn)象，有研究認(rèn)為是因?yàn)樯L的根尖受到重力的作用向下傾斜，而隨著伸長區(qū)的不斷增長，根尖端和基質(zhì)之間反復(fù)接觸，這些重復(fù)的接觸刺激將導(dǎo)致根部生長朝相反的方向重新定向，從而產(chǎn)生扭曲的旋向變化[8， 11]。此外，也有研究表明wave的產(chǎn)生是由于根無法穿透基質(zhì)，因此向一側(cè)發(fā)生橫向生長，而重力會糾正這個軌跡使根向另一個方向生長，從而產(chǎn)生彎曲[11， 16]。上述研究中的基質(zhì)與本研究中的蠟塊本質(zhì)上是一樣的。

目前為止，BRs導(dǎo)致根不對稱生長發(fā)生wave和coiling的機(jī)理還仍然未知。接觸刺激為何會改變根對BRs的生理反應(yīng)也尚不清楚。因此這些都將是今后研究的重點(diǎn)，其分子機(jī)理也有待進(jìn)一步探索。本研究發(fā)現(xiàn)水稻根不對稱生長的大量發(fā)生需要BRs和接觸刺激的共同作用，并發(fā)現(xiàn)接觸刺激能促進(jìn)BRs導(dǎo)致的水稻根不對稱生長，為了解BRs與接觸刺激之間的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

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