付影 于旭東 蔡澤坪 吳繁花 羅佳佳

摘 要 在野外考察中發(fā)現了菠蘿蜜白化突變體，并對其形態(tài)和生理方面進行了研究。通過分光光度計法、離體稱量法、比色法等比較研究菠蘿蜜實生白化苗與正常苗在形態(tài)指標和生理指標方面的差異。結果表明：菠蘿蜜白化突變體的株高、側根密度、莖粗、葉柄長、葉片長、葉片寬、葉面積、葉周長、葉綠素含量均低于正常苗，而含水量、蒸騰速率、脯氨酸含量均高于正常苗。菠蘿蜜白化突變體和正常苗無論在形態(tài)還是生理上都有很大的差別。本研究不僅為木本經濟作物白化突變體的研究提供材料，而且為進一步研究菠蘿蜜白化苗的形成機制提供參考依據。

關鍵詞 菠蘿蜜；白化突變體；形態(tài)指標；生理指標

中圖分類號 S667.8 文獻標識碼 A

Characters of Albino Mutant of Artocarpus heterophyllus Lam.

FU Ying1， YU Xudong1， CAI Zeping1*， WU Fanhua1， LUO Jiajia1，2

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Danzhou， Hainan 571737， China

2 Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract An albino mutant of Artocarpus heterophyllus Lam. was discovered in field investigation， and its morphological and physiological aspects were studied. The differences between the morphological indexes and physiological indexes of A. heterophyllus were studied by spectrophotometry， vitro weighing method and colorimetric method. The results showed that plant height， lateral root density， stem diameter， petiole length， leaf length， leaf width， leaf area， leaf perimeter， chlorophyll content and of the albino mutants were lower than those of normal seedlings. However， the transpiration rate and proline content of the mutant were higher than those of the normal seedlings. There were big differences in morphology and physiology of the albino mutants and normal seedlings. This experiment not only provides materials for the study of albino mutant of woody economic cro ps， but also provides reference for further study on the formation mechanism of albino seedlings of A. heterophyllus.

Key words Artocarpus heterophyllus Lam.； albino mutant； morphological index； physiological index

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.007

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）又稱木菠蘿、樹菠蘿，桑科（Moraceae）木菠蘿屬（Artocarpus）常綠喬木。菠蘿蜜是集水果鮮食、木本糧食和珍貴木材于一體的經濟作物，是世界著名的熱帶果樹[1]。近年來對菠蘿蜜果實加工研究較多，但生理和形態(tài)方面的研究較少，且白化突變體的形態(tài)、生理和分子生物學研究均未見報道。白化苗是一種植物的變異，是科學研究的特殊材料，但白化現象會造成農林生產上的損失[2]。因此白化苗的形成機理及分子機制受到了國內外科研人員的廣泛關注和研究。已有報道在許多植物的實生苗以及組培苗中發(fā)現白化現象，比如版納省藤（Calamus nambariensis Becc. var. xishuangbannaenis S.J.Pei et S.Y.Chen）、苦瓜（Momordica charantia L.）、水稻（Oryza sativa L.）、花生（Arachis hypogaea L.）、玉米（Zea mays L. Sp.）、豌豆（Pisum sativum L.）、椰子（Cocos nucifera L.）、蘇鐵（Cycas revoluta Thunb.）、楨楠（Cycas revoluta Thunb.）、斐濟貝殼杉[Agathis macrophylla （Lindl.） Mast.]、印度八角楓（Alangium lamarckii Thwaites）等植物[2-12]。

與草本植物相比，木本植物生長周期長，突變體研究較為困難，白化突變體的研究更少。此次筆者在野外首次發(fā)現菠蘿蜜白化突變體，并對比分析其與正常苗形態(tài)和生理指標的差異，為進一步研究菠蘿蜜白化苗的形成機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為白化和正常的菠蘿蜜幼苗，均采自海南省儋州市，每株苗帶有完整的根、莖、葉，保濕帶回實驗室，進行指標測量。儀器主要有光學顯微鏡、電子分析天平、電熱恒溫干燥箱和分光光度計等。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學觀察 根、莖、葉形態(tài)測量：測量以下指標：主根長、側根密度、株高、莖粗、葉柄長、葉片長、葉片寬、葉面積、葉周長等，重復3次，計算各指標的平均值和標準差。葉各項指標測量均選擇幼苗中最大的一枚葉。

葉表皮的顯微結構觀察：分別剝取葉的上、下表皮放在清潔的載玻片上，制成水封臨時裝片， 進行顯微觀察，選擇清晰的圖像，顯微攝影。測量并記錄的指標包括上下表皮扁平細胞（pavement cell）面積與數量、突出（Lobe）數、Lobe長、頸（neck）寬、氣孔器密度（stomatal density）、氣孔器數量、氣孔器指數（stomatal index）等，氣孔密度=單位面積內氣孔數量/面積（mm2）。氣孔指數=單位面積內氣孔數量/（單位面積內氣孔數量+單位面積內表皮扁平細胞數）×100%。重復6次，數值以“平均值±標準差”表示。

1.2.2 生理指標測定 葉綠素含量測定：取新鮮葉片，參照張志良[13]的方法提取葉綠素。將葉綠素提取液在波長663、645 nm下測定吸光度，每個樣品重復3次。利用Arnon法公式計算葉綠素含量[14]。

含水量測定：剪下根、莖、葉和子葉后立即稱鮮重；分別裝入潔凈干燥的自封袋，放入烘箱，恒溫60 ℃烘至恒重。烘干后立即稱重，得到根、莖、葉和子葉的干重，每個樣品重復3次。相對含水量（relative water content，RWC）的計算公式：

RWC=（鮮重-干重）/鮮重×100%。

蒸騰速率測定：取新鮮葉片，參照劉萍等[15]提出的離體測量法測定蒸騰速率，每個樣品重復3次。

脯氨酸和可溶性糖含量測定：取新鮮植株，參照李合生[16]提出的比色法分別測定脯氨酸含量和可溶性糖含量，每個樣品重復3次。

1.3 數據處理

試驗數據的統(tǒng)計和分析均采用SPSS 19.0和Excel 2010軟件，采用LSD檢驗和Duncan法進行數據差異顯著性多重比較。

2 結果與分析

2.1 白化突變體自然生長情況

對發(fā)現白化苗的母樹（正常）下的幼苗進行統(tǒng)計，總共發(fā)現39株幼苗，其中白化苗10株，占全部苗的25.6%（圖1）。將白化苗移栽到含有營養(yǎng)土的花盆中放入溫室大棚培養(yǎng)，發(fā)現白化現象并無改變，說明白化現象的產生不是環(huán)境造成的，可能是由于基因突變或葉綠素合成受阻等造成的。

2.2 形態(tài)學分析

2.2.1 根、莖和株高的形態(tài)學比較 菠蘿蜜白化突變體幼苗的株高[（364.67±62.20） mm]比正常苗[（457.36±18.56） mm]矮（圖2-A）。雖然其主根長[（176.45±41.23） mm]與正常苗[（196.23±26.71） mm]相當，但側根密度[（2.40±0.29）個/mm]小于正常苗[（3.75±0.63）個/mm]，差異極顯著（圖2-A、B）。同時，突變體的莖較為瘦弱（圖2-C）。

2.2.2 葉的形態(tài)學比較 菠蘿蜜白化突變體葉柄長、葉片長和葉片寬均小于正常苗，分別是正常苗的47.2%、45.7%和41.2%，差異極顯著；突變體葉面積和葉周長均小于正常苗，但葉周長/葉面積大于正常苗，是正常苗的近3倍，差異極顯著；在葉片長/葉柄長與葉片長/葉片寬中，突變體（11.45±1.12與2.00±0.17）與正常苗（12.08±1.88與1.79±0.23）相比差異不顯著；由此可見，葉形差異不大，但尺寸顯著縮小了（表1，圖1）。

2.2.3 葉表皮扁平細胞和氣孔器的形態(tài)學分析 葉表皮扁平細胞比較：突變體表皮扁平細胞較小，上、下表皮扁平細胞面積均約為正常苗的1/3，而其密度分別是正常苗的4倍和2.5倍，差異極顯著（圖3-B、D，表2）。突變體表皮扁平細胞邊緣彎曲較少，Lobe數目減少而且Lobe的長度變短，上、下表皮扁平細胞的Lobe數分別是正常苗的78.3%和63.8%，Lobe長度分別為正常苗的53.2%和74.5%，差異均極顯著；上下表皮扁平細胞Neck寬度分別為正常苗的60.9%和81.8%，差異極顯著（圖3，表2）。

氣孔器比較：菠蘿蜜氣孔器由2個腎形的保衛(wèi)細胞（guard cells）組成，沒有副衛(wèi)細胞（accessory cells）。突變體與正常苗上表皮均沒有氣孔的分布，氣孔器只存在于下表皮。突變體氣孔面積發(fā)生變化，氣孔的長寬減小，氣孔指數減小，氣孔面積（stomatal area）是正常苗的67.7%，氣孔的長和寬分別為正常苗的78.0%和89.4%，氣孔長寬比為正常苗的82.9%，差異極顯著。氣孔指數是正常苗67.1%，差異極顯著。而氣孔密度大于正常苗，是正常苗的1.6倍（圖3-B、D，表3）。

2.3 生理指標分析

2.3.1 含水量比較 從表4可知，突變體整個植株的含水量高于正常苗，葉片、莖和子葉的含水量均大于正常苗，差異極顯著；而根含水量與正常苗相當，無明顯差異。

2.3.2 葉蒸騰速率（Tr）和葉綠素含量（Chl）比較 白化突變體葉綠素含量發(fā)生變化，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量接近0，遠小于正常苗（表5）；蒸騰速率[（77.51±7.81） g.m-2.h-1]比正常苗[（48.15±7.95） g.m-2.h-1]高60%，差異極顯著（圖4-A）。

A：正常苗葉片上表皮細胞；B：正常苗葉片下表皮細胞；C：突變體葉片上表皮細胞；D：突變體葉片下表皮細胞；標尺為50 μm。

A： Upper epidermis cells of normal leaves； B： Lower epidermis cells of normal leaves； C： Upper epidermis cells of mutant leaves； D： Lower epidermis cells of mutant leaves； The scale is 50 μm.

2.3.3 可溶性糖和脯氨酸（Pro）含量比較 突變體脯氨酸含量[（145.75±6） μg/g]極顯著高于正常苗[（38.38±5） μg/g]，是正常苗的近4倍（圖4-B）；但突變體可溶性糖含量[（0.240±0.014） g/hg]與正常綠苗相比[（0.255±0.021） g/hg]無明顯差異（圖4-C）。

3 討論

葉表皮主要由表皮扁平細胞、氣孔保衛(wèi)細胞（Stomatal guard cell）和表皮毛（Trichrome）3類細胞構成[17]。表皮原始細胞沿葉長軸擴展，形成變長的多邊形細胞；細胞開始產生向外的生長點（Outgrowths），或沿著細胞壁的背斜面向相鄰細胞側面延伸形成多處Lobes，Lobes和Necks進一步的延伸，最終形成相互交錯的表皮扁平細胞[18]。菠蘿蜜白化突變體與正常苗相比，整體長勢較弱。其側根密度、株高、莖粗、葉柄長、葉片長、葉片寬、葉面積、葉周長、葉綠素含量等都低于正常苗。葉綠素是植物進行光合作用的重要色素，葉綠素含量大小直接決定葉片光合能力的強弱[19]。白化苗中含有微量的葉綠素，而不是人們普遍認為的白化苗不含葉綠素，但是其葉綠素含量遠低于正常苗，含量近乎0。Bae等[20]在煙草白化苗中檢測出微量葉綠素，與本研究結果一致。白化苗葉綠素含量非常低，光合作用極弱，只能依靠子葉提供營養(yǎng)。突變體不能進行正常的光合作用，可能是導致突變體生長勢（growth vigor）弱的重要原因。

植物一方面從土壤中吸收水分，另一方面又向大氣中蒸騰散失水分。蒸騰作用在響應土壤水分脅迫時是判斷植物抗旱性強弱的一項重要參數[21]。葉片是植物進行同化與蒸騰作用的主要器官，也是植物對干旱脅迫最敏感的器官。葉片上的氣孔是植物與外界環(huán)境之間水、氣交換的主要通道，直接控制蒸騰強度。實驗結果表明，突變體葉片的水分散失速率比正常苗高60%。這與突變體葉片氣孔密度比正常苗高60%相互印證。然而突變體植株含水量明顯高于正常苗，這可能與植物體內脯氨酸、可溶性糖等溶質的含量有關。

脯氨酸在動物、植物、真菌、藻類中均有積累，是已知的在植物中分布最廣的滲透保護物質。在非生物脅迫條件下，植物的生長發(fā)育受到不同程度的影響。許多實驗證明脯氨酸的累積能夠提高植物對環(huán)境脅迫的耐受力[22-23]。菠蘿蜜白化突變體脯氨酸的含量明顯高于正常苗，是正常苗的近4倍。說明突變體受環(huán)境脅迫程度深，可能與白化苗的生長發(fā)育不良有關，而長勢較好的正常苗脯氨酸含量較低。脯氨酸含量還與植物體內水分狀況的變化關系十分密切[24]。脯氨酸與細胞內的一些化合物形成聚合物，類似親水膠體，有一定的保水作用，可能也是植株含水量高于正常苗的重要原因。

糖是代謝的中間產物或終產物，調節(jié)植物的生長、發(fā)育等多個生理過程，參與胞內信號調節(jié)和轉導過程，在植物生長、發(fā)育、成熟和衰老等過程中發(fā)揮調控作用[25]?？扇苄蕴鞘枪夂献饔玫漠a物，在一定程度上反映光合產物的積累和運轉情況[26]。由于突變體不能進行正常的光合作用，主要依靠從種子中吸收的營養(yǎng)維持生命活動。突變體的可溶性糖含量與正常苗差別不大，說明此時的菠蘿蜜白化苗還能通過子葉提供的營養(yǎng)物質繼續(xù)生長。

本研究結果表明，白化苗的整體長勢弱于正常苗，可能與白化突變體葉綠素含量低，不能進行正常的光合作用有關。白化突變體生長發(fā)育不正常導致脯氨酸含量高于正常苗。菠蘿蜜白化突變體的形成機制還需要進一步的研究，研究白化突變體的成因進而控制其形成也是當前作物育種中亟待解決的一個問題。

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