陶琳 叢子文 周雙清 黃東益 吳文嬙 許云 夏薇 張榮萍 黃小龍

摘 要 為了從海洋微生物中尋找農(nóng)藥先導(dǎo)化合物，本研究通過16S rRNA基因序列分析對(duì)具有抗真菌活性的海洋放線菌HNM0089的種屬進(jìn)行鑒定，并對(duì)其抗真菌的活性成分進(jìn)行研究。結(jié)果表明：海洋放線菌HNM0089被鑒定為弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）。利用高分辨質(zhì)譜、一維和二維核磁波譜技術(shù)，將其主要活性成分鑒定為星形孢菌素（Staurosporine）。該化合物對(duì)芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、薯蕷炭疽病菌和橡膠炭疽病菌均有抑制活性，具有開發(fā)成農(nóng)用抗菌素的潛力。

關(guān)鍵詞 海洋放線菌；弗氏鏈霉菌；抗真菌活性；星形孢菌素；農(nóng)用抗菌素

中圖分類號(hào) Q939.92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract A marine actinomycetes strain HNM0089 with antifungal activity was identified by 16s rRNA and its antifungal active ingredients was studied. The results showed that strain HNM0089 was identified as Streptomyces fradiae and the main active component was identified as staurosporine by the means of HRESI-MS， 1D-NMR， and 2D-NMR. The compound has inhibitory activity against Colletotrichum asianum， Magnaporthe grisea， Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4， Colletotrichum gloeosporioides Cg9， Colletotrichum gloeosporioides RC178 and has potential to be developed into agrochemical antibiotic.

Key words Marine actinomycete； Streptomyces fradiae； antifungal activity； staurosporine； agrochemical antibiotic

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.022

海洋微生物因其特殊的生存環(huán)境形成了獨(dú)特的代謝途徑、生存繁殖方式和適應(yīng)機(jī)制，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特的次級(jí)代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已成為了海洋活性天然產(chǎn)物的重要來源之一[1-3]。目前，從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了許多具有良好抗菌活性的化合物[4-5]，其中不少活性化合物在植物病蟲害的生物防治中呈現(xiàn)出誘人的應(yīng)用前景[6-8]。如海洋魯特格斯鏈霉菌鼓浪嶼亞種 （Streptomyces rugersensis subsp. gulangyunensis）產(chǎn)生的春日霉素類抗生素8510-I，對(duì)稻瘟病等植物病原菌具有極好的防治效果[9]。海洋細(xì)菌BAC-9912產(chǎn)生的寧康霉素，對(duì)立枯絲核菌、灰霉病菌、蘋果輪紋病菌等植物致病菌具有很強(qiáng)的抑制作用[10]。因此，海洋微生物正成為尋找結(jié)構(gòu)獨(dú)特新型農(nóng)用抗菌素的重要資源[11-12]。本實(shí)驗(yàn)室前期從海南文昌海域分離得到104株海洋放線菌，并進(jìn)行了拮抗芒果采后炭疽病菌的活性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海洋放線菌HNM0089對(duì)本實(shí)驗(yàn)室新報(bào)道的芒果炭疽病菌（Colletotrichum asianum）[13]具有良好的拮抗活性（圖1）。為了明確海洋放線菌HNM0089的分類地位和抗菌活性成分，本研究對(duì)其16S rRNA基因序列進(jìn)行分析，并對(duì)其活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和活性評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步的產(chǎn)物研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 放線菌HMN0089菌株為本實(shí)驗(yàn)室從海南文昌海域采集的海綿樣品中分離得到。芒果采后炭疽病菌（Colletotrichum asianum T0408）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4）、薯蕷炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides Cg9）和橡膠炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesRC178）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2 儀器與試劑 1H NMR、13C NMR及二維（HSQC、1H-1HCOSY、HMBC）相關(guān)核磁共振由Bruker DPX-400 Bruker DPX-600核磁共振儀測(cè)定；質(zhì)譜測(cè)試使用Agilent公司的6210 TOF LC-MS儀器；ZF-I 型紫外分析儀。半制備高效液相層析：層析柱為250 mm×10 mm，粒徑5 μm的Hypersil反相高效液相層析柱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific），配備L-7110泵和L-7420 UV/Vis檢測(cè)器的Hitachi HPLC系統(tǒng)。薄層層析用黃海硅膠TLC板（煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司）。凝膠層析所用填料為Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia Biotech）。柱層析所用硅膠（200～300目）（青島海洋化工廠）。常規(guī)提取分離用甲醇（MeOH）、乙酸乙酯（AcOEt）、石油醚（PE）、二氯甲烷（CH2Cl2）均為工業(yè)用化學(xué)純產(chǎn)品，液相色譜甲醇（EtOH），液相色譜純水，洗脫劑添加的酸為分析純的三氟乙酸（TFA）。

1.1. 3 培養(yǎng)基 酵母膏麥芽膏培養(yǎng)基（ISP2）：酵母膏4 g，麥芽浸粉10 g，葡萄糖4 g，蒸餾水1 L，瓊脂20 g，pH 7.3。

種子培養(yǎng)基：胰酪蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨 3.0 g，葡萄糖 2.5 g，氯化鈉 5.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g， 蒸餾水1 L，pH 7.3。

發(fā)酵培養(yǎng)基K：可溶性淀粉25 g，黃豆粉15 g，酵母浸粉2 g，CaCO3 4 g，海鹽27 g，純水1 L，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株HNM0089的分子生物學(xué)鑒定 參照周雙清等[14]的方法進(jìn)行菌株DNA的提取、16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定，將獲得的序列登錄EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ezbiocloud.net/）中作同源序列比對(duì)搜索，同時(shí)下載相關(guān)相似菌株序列，用Mega6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

1.2.2 菌株的發(fā)酵 將斜面保存的菌種HMN0089接種到ISP2固體培養(yǎng)基平板上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。將活化的菌種HNM0089轉(zhuǎn)接到裝有200 mL種子培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，于28 ℃，142 r/min搖床培養(yǎng)48 h，作為種子液。取10 mL種子液接種到裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基K的1 L三角瓶中，共接種200瓶，于28 ℃，142 r/min 搖床培養(yǎng)10 d。

1.2.3 化合物的分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定 將1.2.2中所得的發(fā)酵液經(jīng)3倍體積的乙酸乙酯溶劑萃取后減壓旋蒸濃縮得到黃色粗提物6.0 g，該粗提物經(jīng)200～300目硅膠柱色譜，以石油醚-二氯甲烷-甲醇（V：V：V，100：0：0，0：100：0，0：100：1，0：100：2，0：100：4，0：100：8，0：100：16，0：0：100）梯度洗脫，HPLC檢測(cè)和活性分析后選取第5個(gè)和第6個(gè)流分，合并后經(jīng)HPLC-C18反相制備（體積分?jǐn)?shù)為90：10：0.15的MeOH-H2O-TFA洗脫，流速為2 mL/min）得到化合物TL-1（30 mg）；再通過HRESI-MS確定分子式和分子量，并確定1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HMQC等的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 抗植物病原真菌活性測(cè)定 采用微量稀釋法對(duì)抗5種供試植物病原真菌的活性進(jìn)行測(cè)定，以無菌DMSO為溶劑，將化合物TL-1配制成1 280 μg/mL的母液。然后采用倍比稀釋法依次稀釋得到濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL的樣品液。陽性對(duì)照放線菌酮的稀釋方法同上。通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)將供試病原真菌的孢子制備成（2～4）×106個(gè)孢子/mL的菌液。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔分別加入100 μL的樣品液和100 μL的孢子液（每種菌同時(shí)作空白對(duì)照），于28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察各孔中孢子的生長(zhǎng)狀況，以無菌生長(zhǎng)的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

采用PCR擴(kuò)增得到菌株HNM0089的16S rRNA基因序列，有效片段長(zhǎng)度為1 594 bp，提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得序列號(hào)MG020663。在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行有效種的序列相似性搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株HNM0089與鏈霉菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性最高，其相似率在98.13%～100%之間。其中與之相似率最高的鏈霉菌為Streptomyces fradiae NBRC 3439T（相似率為100%），基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示菌株HNM0089與Streptomyces fradiae NBRC 3439T聚在同一分支，且遺傳距離幾乎為零（圖2）。故鑒定菌株HNM0089為弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）。

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

從菌株HNM0089的代謝物中分離、純化獲得主產(chǎn)化合物TL-1。該化合物為黃綠色無定型粉末，正離子ESI-MS給出m/z 467.2098（[M+H]+），確定其分子式為C28H26N4O3，計(jì)算其不飽和度為18，紫外顯示在291 nm處有尖銳特征吸收。1H NMR低場(chǎng)區(qū)給出2個(gè)活潑氫信號(hào)δH（9.02， 1H， d， 23.7），（8.65， 1H， s），7.2-9.4 ppm給出8個(gè)芳香氫信號(hào)，高場(chǎng)區(qū)給出12個(gè)氫信號(hào)；13C NMR中共28個(gè)碳信號(hào)，低場(chǎng)區(qū)包括1個(gè)羧基信號(hào)（δC 172.36），18個(gè)芳香碳信號(hào)，高場(chǎng)區(qū)包括4個(gè)次甲基信號(hào)，2個(gè)亞甲基信號(hào)，3個(gè)甲基信號(hào)。1H-1H COSY數(shù)據(jù)顯示H-1和H-2相關(guān)，H-2和H-3相關(guān)，H-3和H-4相關(guān)，H-6和H-7相關(guān)，H-8和H-9相關(guān)，H-10和H-11相關(guān)，H-6和H-5相關(guān)，H-5和H-4相關(guān)，H-4a和H-4b相關(guān)，可將關(guān)聯(lián)片段連出。HMBC數(shù)據(jù)顯示H-2和C-4、C-13a相關(guān)，H-3和C-4a相關(guān)，H-4和C-2、C-4b、C-13a相關(guān)，H-6和C-4c、C-5、C-7、C-7a相關(guān)，H-7和C-4b、C-4c、C-5、C-7a相關(guān)，H-8和C-7b、C-7c相關(guān)，H-11和C-11a相關(guān)，這些信息確定該化合物有吲哚咔唑母核結(jié)構(gòu)。此外H-2a和C-2、C-6相關(guān)，H-3和C-3a、C-4、C-5相關(guān)，H-3a和C-3相關(guān)，H-4b和C-4相關(guān)，H-5和C-3a相關(guān)，可確定糖環(huán)的結(jié)構(gòu)，同時(shí)H-6和C-2、C-12a、C-12b相關(guān)，故可將母環(huán)和糖環(huán)連接起來，結(jié)構(gòu)如圖3。其核磁數(shù)據(jù)如表1 所示，通過文獻(xiàn)比較，化合物TL-1與星形孢菌素的核磁數(shù)據(jù)一致[15]，因此確定化合物TL-1為星形孢菌素（staurosporine）。

2.3 抗植物病原真菌活性

由表2可知，化合物TL-1對(duì)芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、薯蕷炭疽病菌、橡膠炭疽病菌和香蕉枯萎病菌均有顯著的抑菌活性，最小抑菌濃度（MIC）值分別為0.125、8、8、8、8 μg/mL。其中對(duì)芒果炭疽病菌的抗菌活性優(yōu)于陽性藥放線菌酮，對(duì)香蕉枯萎病菌的抗菌活性低于放線菌酮，對(duì)其它3種病菌的抗菌活性與放線菌酮相當(dāng)。

3 討論

星形孢菌素（staurosporine）是Omura等[16]從土壤鏈霉菌Streptomyces staurosporeus AM-2282的發(fā)酵產(chǎn)物中分離的第1個(gè)吲哚咔唑類生物堿，顯示有抗真菌的活性。Furasaki等[17]獲得了星形孢菌素的單晶，并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。Tamaoki等[18]發(fā)現(xiàn)星形孢菌素具有極強(qiáng)的抗腫瘤活性，屬于一類細(xì)胞膜滲透性良好的非選擇性蛋白激酶抑制劑。從此該生物堿受到廣泛關(guān)注，長(zhǎng)期被作為一種抗腫瘤先導(dǎo)化合物進(jìn)行研究[19-20]。但近年來，星形孢菌素的農(nóng)藥活性也逐漸被人們所發(fā)現(xiàn)。Park等[21]報(bào)道了星形孢菌素對(duì)Colletotrichum orbiculare、Phytophthora capsici、Rhizoctonia solani、Botrytis cinerea和Cladosporium cucumerinum等植物病原真菌具有相當(dāng)強(qiáng)的抗性，其防治辣椒疫霉病的效果略低于甲霜靈。Cheng等[22]報(bào)道星形孢菌素對(duì)由水稻黃單胞菌引起的水稻白葉枯病具有良好的防治功效。此外，也有報(bào)道星形孢菌素還具有抗蟲活性，對(duì)甜菜夜蛾具有較高殺蟲活性[23-24]。本研究從海洋弗氏鏈霉菌HNM0089中分離到了星形孢菌素，并且發(fā)現(xiàn)其對(duì)芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、薯蕷炭疽病菌和橡膠炭疽病菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，充分表明星形孢菌素具有較廣的抗菌譜，具備開發(fā)成廣譜農(nóng)用抗菌素的潛力，但其抗菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 趙成英，朱統(tǒng)漢，朱偉明. 2010-2013之海洋微生物新天然產(chǎn)物[J]. 有機(jī)化學(xué)，2013， 33（6）：1 195-1 234.

[2] Dharmaraj S. Marine Streptomyces as a novel source of bioactive substances[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26（12）：2 123-2 139.

[3] 王 聰，梅顯貴，朱偉明. 海洋鏈霉菌來源的天然產(chǎn)物[J]. 海洋科學(xué)集刊，2016：86-124.

[4] 崔海信，魏 剛，陶黎明. 海洋微生物源殺菌化合物的研究進(jìn)展[J]. 浙江化工，2009，40（10）：10-14.

[5] El-Hossary E M，Cheng C，Hamed M M，et al. Antifungal potential of marine natural products[J]. European Journal of Medicinal Chemistry，2017，126（4）：631-651.

[6] 付泓潤(rùn)，馬桂珍，葛平華，等. 海洋微生物及其代謝產(chǎn)物在植物保護(hù)上的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（6）：7-12.

[7] 閻 坤，高菊芳. 海洋微生物源農(nóng)用抗生素研究[J]. 世界農(nóng)藥，2014，36（3）：20-26.

[8] Wang J，He W，Huang X，et al. Antifungal new oxepine-containing alkaloids and xanthones from the deep-sea-derived fungus Aspergillus versicolor SCSIO 05879[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2016，64（14）：2 910-2 916.

[9] 方金瑞. 海洋微生物：開發(fā)海洋藥物的重要資源[J]. 中國(guó)海洋藥物，1998，67（3）：53-56.

[10] 劉 麗，胡江春，李曉茹，等. 寧康霉素對(duì)植物病原真菌的抑制作用[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（2）：182-185.

[11] 閻世江，劉 潔. 海洋微生物應(yīng)用于生物農(nóng)藥的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥市場(chǎng)信息，2014，10（1）：4-6.

[12] 許蘭蘭，黃 曦，黃庶識(shí)，等. 來源于海洋真菌的農(nóng)用抗生素的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥，2009，48（10）：703-707.

[13] 孫 珊，譚麗玲，龐小婧，等. 芒果采后炭疽病Colletotrichum asianum鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2016，37（12）：2 392-2 397.

[14] 周雙清，黃小龍，黃東益，等. Chelex-100快速提取放線菌DNA作為PCR擴(kuò)增模板[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2010（2）：123-125.

[15] Schupp P，Eder C，Proksch P，et al. Staurosporine derivatives from the Ascidian Eudistoma toealensis and Its predatory flatworm Pseudoceros sp.[J]. Journal of Natural Products，1999，62（7）：959-962.

[16] Omura S，Iwai Y，Hirano A，et al. A new alkaloid AM-2282 of Streptomyces origin taxonomy，fermentation，isolation and preliminary characterization[J]. The Journal of Antibiotics，1977，30（4）：275-282.

[17] Furasaki A，Hashiba N，Matsumoto T，et al. The crystal and molecular structure of staurosporine，a new alkaloid from a streptomyces strain[J]. The Chemical Society of Japan，1982，55（18）：800-801.

[18] Tamaoki T，Nomoto H，Takahashi I，et al. Staurosporine，a potent inhibitor of phospholipid Ca++ dependent protein kinase[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1986，135（2）：397-402.

[19] Sánchez C，Méndez C，Salas J A. Indolocarbazole natural products：occurrence，biosynthesis，and biological activity[J]. Natural Product Reports，2006，23（6）：1 007-1 045.

[20] Salas J A，Méndez C. Indolocarbazole antitumour compounds by combinatorial biosynthesis[J]. Current Opinion in Chemical Biology，2009，13（2）：152-160.

[21] Park H J，Lee J Y，Hwang I S，et al. Isolation and antifungal and antioomycete activities of staurosporine from Streptomyces roseoflavus strain LS-A24[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（8）：3041-3046.

[22] Cheng J，Park S B，Kim S H，et al. Suppressing activity of staurosporine from Streptomyces sp. MJM4426 against rice bacterial blight disease[J]. Journal of Applied Microbiology，2015，120（4）：975-985.

[23] McCoy K M，Hatton C J. Insecticidal activity of staurosporine：U.S. Patent 4，735，939[P]. 1988-4-5.

[24] 蒲小明，林壁潤(rùn)，胡美英，等. 鏈霉菌4138殺蟲成分及對(duì)甜菜夜蛾的毒力測(cè)定[J]. 中國(guó)生物防治，2008，24（2）：163-167.