張蒙 潘騰飛 余磊 楊華麗 潘東明

摘 要 為探究花色基因FOMT2在中國(guó)水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）類黃酮代謝途徑中的功能作用，以期明確小分子化合物甲基化修飾在水仙類黃酮代謝中的作用，本研究以多花水仙“金盞銀臺(tái)” （Narcissus tazetta var. chinensis ‘jinzhanyintai）不同時(shí)期的花器官為材料，提取總RNA，采用RACE與RT-PCR結(jié)合的方法，克隆得到NtFOMT2基因的cDNA全長(zhǎng)。結(jié)果表明：NtFOMT2基因的cDNA全長(zhǎng)為1 404 bp，其中5′ UTR長(zhǎng)度為33 bp， 3′ UTR長(zhǎng)度為279 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 092 bp，共編碼363個(gè)氨基酸。定量PCR分析結(jié)果表明，NtFOMT2基因表達(dá)水平在水仙花器官的不同時(shí)期差異很大，其表達(dá)模式表現(xiàn)為II>I>III>IV。此外，為分析水仙花色素基因的調(diào)節(jié)因素，以基因組DNA為模板，采用染色體步移法，成功克隆并分析NtFOMT2基因的5端調(diào)控序列。結(jié)果表明，NtFOMT2基因啟動(dòng)子序列除包含起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)（transcription start site，TSS）TATA-box、CAAT增強(qiáng)子外，還包含多個(gè)順式作用元件，如ACE、ATCT-motif、G-box、Sp1等多個(gè)光響應(yīng)元件。此外，該啟動(dòng)子序列還含有MYB參與抗旱誘導(dǎo)的結(jié)合位點(diǎn)MBS元件、MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等。

關(guān)鍵詞 中國(guó)水仙；基因；克??；FOMT；啟動(dòng)子；類黃酮

中圖分類號(hào) S682.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to explore the function of FOMT2 gene in the flavonoid metabolic pathway in Narcissus tazetta. Var chinensis， and to clarify the function of the methylation modification of small molecule compounds in the flavonoid metabolism in Narcissus， the research used Narcissus tazetta. Var chinensis ‘Jinzhanyintai as the meterial to extract total RNA， and the full-length cDNA of NtFOMT2 was cloned with the method of RACE and RT. Results showed that the full length cDNA of NtFOMT2 was 1 404 bp， including a 33 bp 5′ UTR， a 279 bp 3′ UTR and a 1 092 bp ORF encoding 363 amino acids. The results of quantitative PCR showed that the expressions of NtFOMT2 in flower had big difference at different periods. The expression pattern was expressed as： II>I>III>IV. Besides， to analyze the regulating factors of pigment genes in N. tazetta， the regulation sequence of the 5 end of NtFOMT2 gene was cloned with the method of chromosome walking. Results showed that the promoter sequence of NtFOMT2 gene also included cis-acting elements such as ACE， ATCT-motif， G-box， Sp1 and many light responsive elements， besides necessary transcription starting site TATA-box and CAAT enhancer. Furthermore， this promoter sequence included a binding site MBS element participating in drought inducement of MYB， and a MBS binding site of MYB transcription factor and so on.

Keywords Narcissus tazetta var. chinensis； gene； cloning； FOMT； promoter； flavonoid

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.018

植物的O-甲基化（O-Methyltransferase，OMT）反應(yīng)是類黃酮化合物分子修飾的一類重要反應(yīng)，O-甲基化修飾賦予了類黃酮化合物新的生物學(xué)活性[1]。Joshi等[2]根據(jù)蛋白質(zhì)的質(zhì)量和二價(jià)離子對(duì)酶活的影響，將O-甲基轉(zhuǎn)移酶（OMTs）分為咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）和咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）2種類型。I類O-甲基轉(zhuǎn)移酶，即CCoAOMT，其蛋白質(zhì)量在26～30 ku之間，其酶活性需要依賴二價(jià)金屬離子，是合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶；II類O-甲基轉(zhuǎn)移酶，即COMT，其蛋白質(zhì)量在40～43 ku之間，其催化活性不依賴于二價(jià)金屬離子，可催化咖啡酸等苯丙素類化合物及一些類黃酮和生物堿類物質(zhì)[2]。其中，F(xiàn)OMT被劃分在II類O-甲基轉(zhuǎn)移酶中[3]。

植物的O-甲基轉(zhuǎn)移酶（OMTs）被認(rèn)為參與了植物次生代謝產(chǎn)物的甲基化，尤其是苯丙烷類和類黃酮化合物[4]。在這些化合物的主干合成后，會(huì)發(fā)生各種各樣的修飾反應(yīng)。細(xì)胞色素 P450s（P450s）、糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）和O -甲基轉(zhuǎn)移酶（OMTs）已被證明參與了修飾反應(yīng)，從而形成了豐富的類黃酮多樣性[5]。目前，幾個(gè)基因編碼黃酮類O-甲基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)在分子和生物化學(xué)水平上被分離和表征，如長(zhǎng)春花[6]、水稻[5]、染色麻花頭[7]、擬南芥[8]、茶樹(shù)[3]、銀杏[9]、青稞[10]等植物中均克隆得到了OMT基因。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆并分析中國(guó)水仙NtFOMT2基因及其5端調(diào)控序列，根據(jù)前人報(bào)道的分類，該NtFOMT2基因?qū)儆诘诙悾Ｒ远垠w形式存在，其催化活性不需要金屬離子存在[11]。近年來(lái)，雖然已有許多關(guān)于FOMT基因克隆及其表達(dá)調(diào)控等分子生物學(xué)方面的研究，但仍有很多問(wèn)題需要更深入、更細(xì)致的研究。

在前期研究中，柯毅湧[12]認(rèn)為中國(guó)水仙花中未發(fā)現(xiàn)花青素存在，可能是因?yàn)轭慄S酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Flavonoid -O-Methyltransferase，F(xiàn)OMT）能特異識(shí)別蘆丁為底物甲基化形成水仙苷，改變?cè)镔|(zhì)化學(xué)活性，使其在結(jié)構(gòu)上更穩(wěn)定。水仙苷在盛花期前大量積累與花青素爭(zhēng)奪共同的底物二氫槲皮素，從而抑制了花青素的合成[4]。本研究以此為切入點(diǎn)，采用RACE技術(shù)，成功分離出中國(guó)水仙FOMT2基因的全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；采用染色體步移法（Genome Walking Kit），分離NtFOMT2的5端調(diào)控序列，對(duì)所得序列的順式作用元件進(jìn)行分析，從而進(jìn)一步了解水仙FOMT的基因功能，為以后水仙體內(nèi)類黃酮化合物的甲基化修飾的相關(guān)研究提供立論依據(jù)，以期明確小分子化合物甲基化修飾在水仙類黃酮代謝中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以多花水仙‘金盞銀臺(tái)為材料。選用生長(zhǎng)健壯、無(wú)病害、無(wú)殘缺且大小一致的3年生水仙種球進(jìn)行土培，下種時(shí)間為2016年11月5日。于水仙花芽4個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期取6個(gè)樣品：白色的花芽、綠色的花芽、綠苞期的花瓣和副冠、盛花期的花瓣和副冠（表1）。將各樣品分別處理好并做好標(biāo)記，液氮速凍后放于-80℃冰箱備用。

大腸桿菌（Esherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA純化回收試劑盒均為天根公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）購(gòu)于全式金公司；啟動(dòng)子克隆試劑盒Genome Walking Kit購(gòu)自Takara公司。本文中所用引物均由華大基因合成，其名稱及序列見(jiàn)表2。

1.2 方法

1.2.1 中國(guó)水仙FOMT2基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 參照Biospin?多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Biospin Plant Total RNA Extraction Kit）的方法，提取不同時(shí)期的花器官混合樣的RNA。以總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的具體操作合成cDNA。根據(jù)已有的多花水仙RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到中國(guó)水仙FOMT基因序列，利用Primer Premier 5軟件，設(shè)計(jì)出5′端RACE和3′端RACE引物（表1），將克隆得到的序列與原序列拼接后的全長(zhǎng)設(shè)計(jì)ORF引物做驗(yàn)證，引物由華大基因合成。

以多花水仙cDNA為模板進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為25 μL：其中cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，10×Trans Taq-T Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，Trans Taq-T DNA Polymerase 0.2 μL，補(bǔ)ddH2O至總體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；35個(gè)循環(huán)的特異擴(kuò)增（94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s）；72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。第一輪PCR產(chǎn)物用ddH2O稀釋500倍用做第2輪模板，反應(yīng)體系與條件和第1輪PCR相同。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的條帶，連接至pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送至上海博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

利用DNAMAN軟件，將克隆得到的5′端序列及3′端序列及轉(zhuǎn)錄組測(cè)得的部分編碼序列進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)的拼接，經(jīng)Blast比對(duì)分析，將得到的FOMT基因命名為NtFOMT2。

1.2.2 中國(guó)水仙FOMT2基因全長(zhǎng)cDNA的生物信息學(xué)分析 利用NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線比對(duì)；利用DNAMAN8軟件對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)；利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用ExPASy中的Protparam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)其進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

1.2.3 NtFOMT2基因在水仙花芽不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析 采用Biospin?多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取水仙花器官發(fā)育不同時(shí)期和不同部位的總RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent kit（Perfect Real Time）試劑盒的方法合成cDNA。PCR反應(yīng)體系和程序參照SYBR? Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）在耶拿qTOWER2.2熒光定量?jī)x上進(jìn)行檢測(cè)，引物見(jiàn)表1，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。以actin為內(nèi)參基因，利用2-△△CT法對(duì)水仙FOMT2在水仙花器官不同發(fā)育時(shí)期和部位的表達(dá)進(jìn)行分析。

1.2.4 NtFOMT2基因5′端調(diào)控序列的克隆與分析 采用CTAB法[13]對(duì)中國(guó)水仙種球中花芽基因組DNA進(jìn)行提取，參照Takara公司Genome Walking Kit說(shuō)明書(shū)的步驟，根據(jù)所獲得的NtFOMT2基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)3條巢式引物（表2）。以多花水仙基因組DNA為模板，按照說(shuō)明書(shū)的步驟，以PCR擴(kuò)增NtFOMT2基因的5′端調(diào)控序列，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并回收目的條帶，按照pEASY-Blunt Cloning Kit說(shuō)明書(shū)取4 μL純化產(chǎn)物與1 μL載體進(jìn)行連接反應(yīng)，室溫反應(yīng)20 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)到T1感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化完后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行檢測(cè)。用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行啟動(dòng)子作用元件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)水仙FOMT2基因克隆及其生物信息學(xué)分析

以多花水仙的花芽cDNA為模板，用FOMT2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶的清晰度和完整性（圖1），結(jié)果獲得的特異條帶與預(yù)測(cè)的基因片段大小相同，初步確定為目的基因片段。膠回收產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化后送測(cè)序，將已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中NtFOMT2基因中部分序列與獲得的序列進(jìn)行拼接，得到中國(guó)水仙NtFOMT2基因的cDNA全長(zhǎng)。在該全長(zhǎng)設(shè)計(jì)ORF引物，以PCR擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證。

由圖2可知，NtFOMT2基因的cDNA全長(zhǎng)為1 404 bp，其中5′ UTR長(zhǎng)度為33 bp，3′ UTR長(zhǎng)度為279 bp，ORF為1 092 bp，共編碼363個(gè)氨基酸。

2.2 中國(guó)水仙NtFOMT2基因的序列分析

將得到的NtFOMT2基因全長(zhǎng)在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，NtFOMT2基因與中國(guó)水仙黃花水仙（Narcissus tazetta var.chinensis ‘huanghuashuixian caffeic acid O-methyltransferase-like protein）咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT， KC455936.1）的相似度為97%，與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum，XM_020829677.1）的同源性為69%，與油棕（Elaeis guineensis，XM_010936612.2）的caffeic acid 3-O-methyltransferase和tricetin 3'，4'，5'-O-trimethyltransferase-like（XM_010936611.2）同源性均為70%。并且與海棗（Phoenix uctylifera，XM_008790507.2）、煙草、大豆、蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris，XM_020723616.1）等植物的COMT基因進(jìn)行了比對(duì)?；纠砘再|(zhì)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，NtFOMT2基因編碼363個(gè)氨基酸，蛋白分子量為40.00 ku，原子組成為C1790H2810N464O527S23，理論等電點(diǎn)為5.19，負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)為49，正電荷的氨基酸殘基數(shù)為36，不穩(wěn)定系數(shù)為28.56。上述結(jié)果均表明克隆得到的序列為中國(guó)水仙FOMT2基因。

選取18種植物的OMT氨基酸序列與NtFOMT2氨基酸序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，OMT系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為兩大類，其中中國(guó)水仙“金盞銀臺(tái)”與“黃花水仙”、“黃花水仙2號(hào)”的OMT歸為第二類，與第一類中的胡桃、垂枝樺、茶樹(shù)、海棗、大葉楊、胡蘿卜、油棕等植物的OMTs在進(jìn)化上有明顯區(qū)分，這表明不同科屬植物之間的OMT氨基酸序列呈現(xiàn)明顯差異，以100%的bootstrap支持度形成一個(gè)分支，在此分支下，不同科屬植物種類形成一個(gè)分類群（圖3）。

2.3 中國(guó)水仙FOMT2基因的定量表達(dá)分析

由圖4可知，NtFOMT2基因在佛焰總苞形成初期、佛焰總苞形成中期、綠苞期的花瓣和副冠、盛花期的花瓣和副冠中均有表達(dá)，但不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)水平存在較大差異。其中佛焰總苞形成中期表達(dá)量最高，佛焰總苞形成初期表達(dá)量居中，綠苞期和盛花期均下降。

2.4 中國(guó)水仙FOMT2基因的5端序列及其分析

將得到的5端調(diào)控序列提交到在線軟件PlantCare上進(jìn)行分析，結(jié)果表明，中國(guó)水仙FOMT2基因啟動(dòng)子序列除包含必需的起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)（transcription start site，TSS）TATA-box、CAAT增強(qiáng)子外，還有ATCT-motif、ACE、G-box、Sp1等多個(gè)光響應(yīng)元件（圖5）。此外，該啟動(dòng)子序列還含有真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件Box-W1、表達(dá)分生組織相關(guān)元件CAT-box、參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式調(diào)控元件CGTCA-motif、TGACG-motif及MYB參與抗旱誘導(dǎo)的結(jié)合位點(diǎn)MBS元件，并且還發(fā)現(xiàn)一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)MBS。同時(shí)對(duì)NtFOMT2基因啟動(dòng)子順式調(diào)控元件的功能進(jìn)行推測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

植物OMT家族因底物多樣性形成龐大的甲基轉(zhuǎn)移酶家族，類黃酮OMTs通過(guò)爭(zhēng)奪黃酮羥基中的質(zhì)子轉(zhuǎn)移甲基而改變底物結(jié)構(gòu)，并改變底物的理化性質(zhì)和功能[10]。目前關(guān)于植物OMTs cDNA的克隆及其結(jié)構(gòu)、功能的研究較多，但極少有從啟動(dòng)子及其所受轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制著手研究的。本研究成功克隆了中國(guó)水仙“金盞銀臺(tái)”FOMT2基因的全長(zhǎng)，通過(guò)Blast比對(duì)并用MEGA軟件建樹(shù)分析可知，“金盞銀臺(tái)”FOMT2基因與“黃花水仙”有很高的同源性。但在感官上可知，“金盞銀臺(tái)”為白色花瓣，黃色副冠；“黃花水仙”的花瓣、副冠均為黃色系，但副冠的黃色較深。因此說(shuō)明花色的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，并且合成物質(zhì)受多種酶的共同協(xié)調(diào)作用。從水仙花色類黃酮生物合成途徑可知，甲基化反應(yīng)是類黃酮化合物分子修飾的一類重要反應(yīng)，O-甲基化修飾賦予了類黃酮化合物新的生物學(xué)活性。因此，研究FOMT基因在水仙中不同時(shí)期不同器官的表達(dá)量，將有助于揭示水仙花色形成相關(guān)基因表達(dá)之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系，進(jìn)而為水仙花色研究提供新思路。

從表達(dá)特性看，NtFOMT2基因在佛焰總苞形成期表達(dá)量迅速增加，在綠苞期和盛花期的花瓣和副冠中表達(dá)量均降低，說(shuō)明該基因的表達(dá)為下調(diào)模式，這種表達(dá)模式與其同源基因銀杏FOMT和葡萄AOMT的表達(dá)模式相似。已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀杏葉片中該基因表達(dá)模式為春季幼葉>秋季老葉>夏季成熟葉，其表達(dá)也為下調(diào)模式[9]。葡萄AOMT屬可誘導(dǎo)表達(dá)基因，其表達(dá)產(chǎn)物AOMT可能參與了花青素甲基化反應(yīng)。以此類推，NtFOMT2基因表達(dá)產(chǎn)物NtFOMT2可能參與了類黃酮甲基化反應(yīng)。

本研究得到的NtFOMT2基因啟動(dòng)子序列中存在1個(gè)MYB參與抗旱誘導(dǎo)的結(jié)合位點(diǎn)MBS元件，該元件可能受MYB調(diào)控參與了干旱脅迫信號(hào)的響應(yīng)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制；并發(fā)現(xiàn)1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)MBS，進(jìn)一步說(shuō)明NtFOMT2基因的表達(dá)可能受MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。此外，該啟動(dòng)子序列還含有多個(gè)光響應(yīng)元件，如ACE、ATCT-motif、G-box、Sp1等，通過(guò)這些元件可推測(cè)NtFOMT2基因可能參與光合反應(yīng)或受光信號(hào)因子調(diào)控。類黃酮物質(zhì)的生物合成過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，其生物代謝途徑受到大量關(guān)鍵酶基因的直接影響，而這些酶基因的表達(dá)又受到相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[14]?；騿?dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的識(shí)別是研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)而構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵，生物信息學(xué)方法是解決該類問(wèn)題的重要手段[15]。目前，人們已在植物中找到了很多調(diào)控黃酮類此生代謝的轉(zhuǎn)錄因子基因。已從擬南芥[16]、矮牽牛[17-18]、長(zhǎng)春花[19]等許多植物中分離和鑒定了控制次生代謝的多種轉(zhuǎn)錄因子。Debora等[20]發(fā)現(xiàn)在葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，花青素甲基化受干旱脅迫誘導(dǎo)，影響了花青素的積累，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出OMT在干旱脅迫下可能增強(qiáng)葡萄中花青素的甲基化活性的結(jié)論。Gao等[21]研究發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)抑制花青素的合成，參與了植物花色的積累過(guò)程。楊文杰等[22]從大豆中克隆出2個(gè)MYB基因；通過(guò)酵母系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明，GmMYBZ2基因可能也參與植物類黃酮合成的調(diào)控[23]。綜上所述，本研究分離出中國(guó)水仙NtFOMT2基因的cDNA全長(zhǎng)及5端調(diào)控序列，并且分析了其包含的相關(guān)順式作用元件在脅迫響應(yīng)和不同信號(hào)分子誘導(dǎo)中的調(diào)控功能，為今后分離出與之相關(guān)調(diào)控序列特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子提供了依據(jù)，以期明確小分子化合物甲基化修飾在水仙類黃酮代謝中的作用，同時(shí)也為闡明調(diào)控該基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供重要資料。

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