蘇凡 楊小波 李東海 劉子金 岑舉人

摘 要 為了進(jìn)一步深入了解五指山水滿茶的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效，本研究對(duì)五指山水滿茶及其他6種茶（普洱茶、白毛茶、白沙綠茶、西湖龍井、蘭貴人和碧螺春）的提取物的抗氧化活性及其茶多酚、總黃酮含量進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明：7種茶的75%乙醇提取液的抗氧化效果最好，且提取液的抗氧化活性與樣品濃度成正比關(guān)系，整體熱穩(wěn)定性比較好。在7種茶中，水滿茶清除ABTS自由基、超氧自由基和羥自由基的能力最強(qiáng)，且在測(cè)試濃度范圍內(nèi)清除能力均與樣品濃度表現(xiàn)出量效關(guān)系，但水滿茶清除DPPH自由基的能力最弱；還原能力是白毛茶最強(qiáng)，其次是白沙綠茶和水滿茶。7種茶的總黃酮和茶多酚含量分別在3.06%～5.4%和14.6%～18.1%之間，其中，水滿茶的茶多酚含量最低，但總黃酮含量卻最高。因此，五指山水滿茶具有較強(qiáng)的抗氧化活性，較高的總黃酮含量，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效。

關(guān)鍵詞 五指山水滿茶；抗氧化；總黃酮；茶多酚

中圖分類號(hào) TS272 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract For further understanding the nutritional value and health-promoting function of the Hainan Wuzhishan-Shuiman tea， this research compared the antioxidant activities， the contents of tea polyphenols and total flavonoids of Wuzhishan-Shuiman tea with six other teas. Our results showed that 75% ethanol extracts of the seven teas had the highest antioxidant activity. The antioxidant activities of the extracts were proportional to the sample concentrations for the seven kinds of teas，with generally good thermal stabilities. Wuzhishan-Shuiman tea had the best ABTS+·， superoxide and hydroxyl radicals scavenging capacity， with a dosedependent manner in the sample concentration range of the test， but had weaker DPPH· radicals scavenging capacity. Baimao tea had the highest antioxidant activity， followed by Baisha tea and Wuzhishan-Shuiman tea.The content of total flavonoids and tea polyphenols was respectively 3.06%-5.4% and 14.6%-18.1% for the seven teas， Wuzhishan-Shuiman tea was also detected to contain the lowest tea polyphenols， while have the highesttotal flavonoids. In conclusion， Wuzhishan-Shuiman tea has good antioxidant activity and high content of total flavonoids， which is worthy of further exploration and development.

Key words Wuzhishan-Shuiman tea； antioxidant activity； total flavonoids； tea polyphenols

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.010

茶是深受當(dāng)今世界人民喜愛的飲品，不僅因其具有獨(dú)特風(fēng)味，還因?yàn)椴鑼?duì)人體具有營養(yǎng)價(jià)值和保健功效。研究表明，茶葉中含有對(duì)人體有益的茶多酚和黃酮類物質(zhì)，其中黃酮類化合物在抗氧化、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、預(yù)防心血管疾病、防癌、抗癌方面等效果明顯[1-2]，茶多酚氧化聚合形成茶黃素等物質(zhì)，對(duì)心血管疾病的預(yù)防與治療也具有明顯的作用[3]。

海南野生茶為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物，分類學(xué)家認(rèn)為與普洱茶（C. sinensis var. assamica）同是茶的變種[4-5]，五指山地區(qū)的野生茶主要分布于熱帶低地雨林和山地雨林過渡區(qū)域的森林群落中，約在800-1000 m的中海拔地段[6]。五指山水滿茶是采集分布在海南五指山地區(qū)的野生茶的嫩葉制作而成，因主要由海南五指山水滿鄉(xiāng)水滿村村民生產(chǎn)，故稱五指山水滿茶（以下簡稱水滿茶）。根據(jù)加工工藝的不同，可將水滿茶分為綠茶、紅茶?！董偱_(tái)志·土產(chǎn)》中有明確記載，水滿茶有近千年的發(fā)展歷史，在清代曾被列為朝廷貢品[7-9]。水滿茶具有促進(jìn)人體新陳代謝、提神醒腦、消除疲勞，預(yù)防消化不良和消熱解毒等多種功效[10]，已獲得國家農(nóng)業(yè)部地理標(biāo)志登記，成為海南農(nóng)產(chǎn)品新的品牌。五指山市政府安排專項(xiàng)資金，在保護(hù)好生態(tài)的前提條件下，大力發(fā)展水滿茶產(chǎn)業(yè)[9]。目前，有關(guān)水滿茶的抗氧化能力、茶多酚和黃酮含量等相關(guān)指標(biāo)的研究未見報(bào)道。本文研究了水滿茶的抗氧化活性及茶多酚、總黃酮的含量，并與其他6種茶（普洱茶、白毛茶、白沙綠茶、西湖龍井、蘭貴人和碧螺春）進(jìn)行比較分析，對(duì)水滿茶進(jìn)行科學(xué)的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效評(píng)價(jià)，為水滿茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 隨機(jī)在市場(chǎng)上購買五指山水滿香紅茶（海南省五指山椰仙生物科技有限公司）、云南普洱（云南勐海老大為茶葉有限公司）、西湖龍井（杭州梅家塢梅源茶葉有限公司）、白毛茶（廣東省韶關(guān)市仁化紅山）、蘭貴人（?？诤＼Q(mào)易有限公司）、白沙綠茶（海南農(nóng)墾白沙茶業(yè)股份公司）和碧螺春（江蘇溧陽天福觀光茶園有限公司）等成品茶葉（均是春天采摘的一芽兩葉茶葉）作為試驗(yàn)材料。

1.1.2 試劑 正己烷、無水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、水楊酸、30%雙氧水、鹽酸、磷酸、硫酸鋰、溴、VC、氯化鐵、硫酸亞鐵、氯化鋁、乙酸鈉、鐵氰化鉀（廣州化學(xué)試劑廠）；蘆丁、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、NBT（上海麥克林生物有限公司）；DPPH（Sigma公司）；ABTS（東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；沒食子酸（北京百靈威科技有限公司）；L-甲硫氨酸、核黃素（美國Amresco公司）；蒸餾水。以上化學(xué)試劑均為分析純或以上。

1.1.3 儀器 梅特勒-托利多PL303電子分析天平[（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SG5200HB-三頻超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)[（尤尼柯（上海）儀器有限公司]；DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HY-08小型高速粉碎機(jī)（北京環(huán)亞天元機(jī)械有限公司）；Avanti J-25系列高效離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 茶葉提取物的制備 將7種茶葉分別用高速粉碎機(jī)粉碎。稱取每種茶葉粉末樣品各5份、每份2.0 g，置于具塞錐形瓶中，再加入一種提取劑（三氯甲烷，乙酸乙酯，正己烷，75%乙醇，無水乙醇）20 mL，稱定重量后浸泡24 h，用超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz，無溫度控制）1 h，待自然冷卻至常溫后再稱定重量，用對(duì)應(yīng)的提取劑補(bǔ)足損失的重量。搖勻后過濾，濾液在4 000 r/min條件下離心30 min，取上清液備用。

1.2.2 清除DPPH自由基（DPPH·）的能力 參照周靖等[11]的方法測(cè)定茶葉提取液的DPPH自由基清除率。

1.2.3 清除ABTS自由基（ABTS+·）的能力 參照高文霞[12] 的方法測(cè)定茶葉提取液的ABTS自由基清除率。

1.2.4 清除羥自由基（·OH）的能力 參照馬艷芝[13]研究中測(cè)定羥自由基（·OH） 清除率的方法。取1 mL樣品液，加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，200 μL 9 mmol/L H2O2和800 μL的水。37 ℃水浴加熱30 min，在510 nm處測(cè)定吸光值。設(shè)置一個(gè)對(duì)照管和樣底管，對(duì)照管中用水代替茶葉提取液，樣底管中用水代替H2O2。以VC作為陽性對(duì)照。

1.2.5 清除超氧自由基（O2-·）的能力 采用光照核黃素—氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定茶葉提取液的超氧陰離子自由基清除率[14]。

1.2.6 還原能力的測(cè)定 參照劉子金等[15]的方法測(cè)定茶葉提取液的還原能力。

1.2.7 總體抗氧化活性的熱穩(wěn)定性檢測(cè) 取7種茶葉的提取液（濃度8 mg/ml）各1 mL，分別在40～100 ℃下孵育30 min，然后按照1.2.2所述DPPH法測(cè)定樣品的抗氧化活性；將提取液在沸水中分別孵育不同時(shí)間（0～150 min），再采用DPPH法測(cè)定其抗氧化活性。

1.2.8 總多酚和總黃酮含量的測(cè)定 總黃酮含量采用三氯化鋁比色法[16] 測(cè)定，略有改動(dòng)。以蘆?。?、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL）為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用紫外—可見分光光度法，在420 nm波長處測(cè)定吸光度。

總多酚含量采用福林酚（Folin-Ciocalteu）比色法[17-18]測(cè)定，略有改動(dòng)。以沒食子酸（0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/mL）為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用紫外—可見分光光度法，在 760 nm 的波長處測(cè)定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次， 采用Office2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)初步處理， Graphpad Prism5.0軟件作圖，SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種茶葉提取液的抗氧化活性分析

2.1.1 清除DPPH和ABTS自由基的能力 通過DPPH法和ABTS法對(duì)7種茶葉不同溶劑提取液的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在相同濃度（8 mg/mL）下，同一種茶葉的不同溶劑提取液清除自由基的能力不同；在5種提取劑中，75%乙醇提取液清除兩種自由基的能力最好，而無水乙醇次之（圖1）。每種茶葉的75%乙醇提取液對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除率均與提取物濃度呈正量效關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度增加，對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除率也增大（圖2）。

由表1可知，7種茶葉的75%乙醇提取液對(duì) DPPH自由基和ABTS自由基的半抑制濃度有所不同，但均具有較強(qiáng)的清除效果。其中，水滿茶對(duì)ABTS自由基的清除效果最佳， IC50低至 0.439 mg/mL，而蘭貴人的IC50高達(dá)1.278 mg/mL，兩者之間差異極顯著（p<0.01），后者的IC50值約是前者的 2.9 倍；白沙綠茶對(duì)DPPH自由基的清除效果最佳，其IC50低至0.582 mg/mL，而水滿茶對(duì)DPPH自由基的清除效果最差，IC50為1.523 mg/m L，兩者之間差異極顯著（p<0.01），后者的IC50值約是前者的 2.6倍。

2.1.2 清除羥自由基（·OH）和超氧自由基（O2-·）的能力分析 在濃度為0.5～4mg/mL范圍內(nèi)，7種茶葉75%乙醇提取液清除羥自由基的能力隨著濃度的增加而增加，即清除能力與濃度成正比（圖3）。在初始濃度0.5 mg/mL時(shí)，水滿茶提取液的清除率已經(jīng)高達(dá)67.0%，明顯高于其他6種茶葉的清除率，略低于對(duì)照品VC（72.0%）；在濃度為1.5 mg/mL時(shí)，水滿茶提取液的羥自由基清除率（78.2%）已超過VC（74.9%）。

由圖4可看出，在濃度小于或等于2.4 mg/ml時(shí)，水滿茶提取液清除超氧自由基（O2-·）的能力弱于蘭貴人、碧螺春、白沙綠茶、白毛茶和普洱茶，僅高于龍井茶；但當(dāng)濃度大于2.4 mg/mL時(shí)，水滿茶提取液清除超氧自由基（O2-·）能力迅速升高，到4.8 mg/mL時(shí)高于其他6種茶。

2.1.3 還原能力分析 由圖5可知，以沒食子酸作為對(duì)照，7種茶葉的還原能力與提取液濃度成正量效關(guān)系。在濃度為0.06～0.48 mg/mL，水滿茶提取液的還原能力高于碧螺春、蘭貴人、龍井、普洱。與白毛茶相比，在提取液濃度為0.24～0.36 mg/mL時(shí)，水滿茶的還原能力大于白毛茶，但隨著提取液濃度的增加，水滿茶的還原能力又低于白毛茶。水滿茶與白沙綠茶的還原能力較為接近，在提取液濃度為0.06～0.18 mg/mL以及0.48 mg/ml時(shí)，水滿茶的還原能力略低于白沙綠茶；但當(dāng)提取液濃度為0.24～0.42 mg/mL時(shí)，水滿茶的還原能力則略高于白沙綠茶

2.1.4 熱穩(wěn)定性檢測(cè)分析 7種茶葉的75%乙醇提取液在不同溫度下其抗氧化活性變化不大。在40～100 ℃之間，水滿茶、云南普洱、西湖龍井、白沙綠茶碧螺春的抗氧化活性沒有太大變化；在70～90 ℃之間，蘭貴人、白毛茶的抗氧化活性有輕微的上升趨勢(shì)（圖6）。通過研究沸水孵育對(duì)7種茶葉提取液抗氧化活性的影響（圖7）可知，在100 ℃條件下，時(shí)間的延長對(duì)這7種茶葉75%乙醇提取液抗氧化性的影響不顯著。

2.2 茶多酚與總黃酮含量的測(cè)定分析

7種茶葉中的茶多酚和總黃酮含量具體情況見表2。其中，水滿茶的總黃酮含量最高（5.43%），是普洱茶（3.06%）的1.77倍；白沙綠茶、白毛茶、龍井茶這三者的黃酮含量差異不顯著。從7種茶葉的茶多酚含量來看，普洱茶的含量最高（18.1%），而水滿茶的含量最低（14.6%），普洱茶的茶多酚含量是水滿茶的1.24倍。

3 討論

海南五指山地區(qū)海拔相對(duì)較高，屬熱帶山區(qū)氣候，年平均氣溫22.4 ℃，降水量在1 700～1 800 mm之間，雨量充沛，云霧多，可謂“云滋霧養(yǎng)出名茶”，屬生產(chǎn)名優(yōu)茶葉的特佳產(chǎn)地。

目前評(píng)價(jià)茶的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效主要從茶葉的茶多酚、總黃酮含量，茶葉抗氧化活性和還原能力等方面開展定量評(píng)價(jià)?？傸S酮和茶多酚含量均是檢測(cè)保健茶品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)[3， 24]，而且人們普遍認(rèn)為總黃酮和茶多酚含量與抗氧化活性和還原能力成正比[25-27]。但也有研究結(jié)果顯示，除黃酮和茶多酚之外，茶葉中還含有其它組分，如醇類、萜類、醛類、酮類、酸類、生物堿類和不飽和烴類等共同起作用 [28-29]，表現(xiàn)出相對(duì)復(fù)雜的關(guān)系。另外，茶葉中的總黃酮、茶多酚含量及抗氧化活性的大小，因品種不同或不同的研究人員所測(cè)定的結(jié)果而有一定的差異[27， 30]。一般茶葉中總黃酮含量為3%～7.85%[31-32]，茶多酚含量在8.6%～30%范圍[33-34]。

在本研究中，7種茶葉的總黃酮含量在3.06%～5.4%之間，其中水滿茶的總黃酮含量最高為5.4%，屬茶葉中相對(duì)較高的水平；茶多酚含量在14.6%～18.1%之間，其中水滿茶的茶多酚含量最低，為14.6%，屬茶多酚含量一般水平的中偏低水平。從DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基和超氧自由基的清除率以及還原能力等方面比較了水滿茶與普洱茶、白毛茶、白沙綠茶、西湖龍井、蘭貴人和碧螺春的抗氧化活性。結(jié)果表明，水滿茶清除ABTS自由基、羥自由基和超氧自由基的能力最強(qiáng)，還原能力處在中等水平，但對(duì)DPPH自由基清除能力最弱。這一結(jié)果反映出茶葉的抗氧化活性與其化學(xué)成分及含量存在相對(duì)復(fù)雜的關(guān)系，但總體上可看出水滿茶具有較強(qiáng)的抗氧化活性和保健功能。

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