周喆 孫威江 唐秀華 陳志丹

摘 要 以紫芽茶樹武夷奇種C18-1的一芽二葉為試驗材料，采用單因素分析優(yōu)化茶樹花青素總量的提取方法，并分析其不同季節(jié)主要生化成分差異。結果表明：溶劑濃度、浸提時間、浸提溫度等因素對茶樹花青素總量提取均有影響，本研究獲得花青素最佳提取方法為：采用3%的鹽酸乙醇溶液，在80 ℃條件下回流浸提1 h。水浸出物、咖啡堿、茶多酚、花青素及游離氨基酸含量均隨季節(jié)不同而呈現不同的變化規(guī)律，且季節(jié)性差異顯著；水浸出物、咖啡堿、游離氨基酸均在春季中含量最高，茶多酚和花青素均在夏季中含量最高。

關鍵詞 紫芽茶樹；花青素；提取方法；生化成分

中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A

Abstract One bud with two leaves of C18-1 was selected as the experimental material. A single-factor analysis was adopted to optimize the extraction method of anthocyanin in tea plants. The differences of main biochemical components in different seasons of C18-1 were studied. The results showed that the factors such as solvent type， solvent concentration， extraction time and temperature had significant effects on anthocyanin extraction. In this experiment， the optimum extraction method of anthocyanin is： ethanol solution with 3% hydrochloric acid， reflux extraction 1 hour under 80 ℃. The contents of water extracts， caffeine， tea polyphenols， anthocyanin and free amino acids showed different changes with different seasons， and the seasonal differences were significant. The contents of water extracts， caffeine and free amino acids were the highest in spring， and the contents of tea polyphenols and anthocyanin in summer were the highest.

Key words purple shoots of tea plant； anthocyanin； extraction method； biochemical components

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.009

茶樹（Camellia sinensis.（L.） O.Kuntze），為山茶科山茶屬茶種植物，屬于異花授粉植物。我國茶樹種質資源豐富，幼嫩葉片發(fā)生紫化是較為常見的現象。紫化茶樹近年來因其呈現紅紫化新梢和高花青素的保健功效而備受青睞。相關理化研究顯示，高花青素是紫化茶樹呈“紅紫色”的主要原因。隨著花青素合成相關的結構基因表達量增加，可促進花青素合成與積累，進而形成了豐富的紫化茶樹品

種[1-2]，同時其葉色轉變機理及相關保健功能的研究成為熱點?；ㄇ嗨刈鳛樽匣铇涞奶禺愋猿煞郑诒蛔又参镏泻枯^多，根據相關介紹，花青素存在于27個科72個屬的植物中[3]?；ㄇ嗨刈鳛椴豢扇鄙俚拇紊x物，又被稱之為花色素，是水溶性色素，屬類黃酮化合物[4-5]。一般茶葉中的花青素含量占干物質含量的0.01%左右，而在紫化茶樹中可以達到0.5%～1.0%[6]。某些茶樹品種新梢紅紫化程度較高，且主要集中于幼嫩芽葉，成熟葉片含花青素較少。周瓊瓊等[7]比較了茶樹紫芽和成熟綠色葉片的基本生化和成分差異，得出紅紫色芽葉中咖啡堿、茶多酚、兒茶素總量都要高于成熟綠色葉片，且呈極顯著的差異。紅紫色芽葉中類胡蘿卜素的含量、葉綠素總量及葉綠素a、b的含量都極顯著低于成熟綠色葉片，但是其花青素含量相對于綠色成熟葉片較高?；ㄇ嗨卦诓铇淙~片中主要以3種形式存在，即飛燕草素、矢車菊素、天竺葵素[8]。此外，在酸性條件下可轉變成花青素的還有花白素和原花色素（由兒茶素聚合而成）[9-10]?；ㄇ嗨赜兄诟纳迫梭w健康，具有防癌抗癌、保護肝臟、預防阿爾茨海默癥、增進視力等功效。近年來，花青素功能性研究取得較大進展，但是茶葉中花青素的利用甚少，花青素提取的研究引起了廣大學者的關注[11]。王秋霜等[12]優(yōu)化茶葉花青素提取方案，認為花青素提取的最優(yōu)條件為：80%的乙醇、0.6%的鹽酸濃度、料液比1/25、提取3次。陳長應[13]采用高效液相色譜法測定黑綠豆中花青素的主要成分及其含量，色譜柱：250 mm×4.6 mm ZORBAXSB-C18，5 ?m；柱溫：室溫；流動相：甲醇+水，按甲醇∶水=5∶1（體積比）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 ?L，檢測波長：520 nm。黑綠豆中花青素的含量在1.50～13.5 g/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，相對標準偏差為1.25%（N=6），平均回收率達98.4%。該方法簡便快速，結果重現性好，定量準確，準確度、精密度高，適用于黑綠豆提取物中花青素的高效液相色譜分析。李智等[14]以山東黃山群體種茶樹紫色芽葉為材料，通過篩選流動相、優(yōu)化洗脫梯度，建立茶樹紫色芽葉花青素組分鑒定和含量檢測的HPLC分析法，并采用HPLC-DAD-MS/MS聯用技術對茶樹紫色芽葉中花青素組分進行了分離純化和結構鑒定，并從提取的花青素粗制品中分離出9個主要色譜峰；運用HPLC-DAD-MS/MS 聯用技術，獲得了其中7個組分的紫外-可見光譜信息、質譜數據，結合文獻資料，初步推測了茶樹紫色芽葉花青素中5個主要組分。此外，采用外標法對各組分進行了定量分析，并獲得了粗提物，純度為32%。該方法簡便快捷，結果重現性好，可用于茶樹紫色芽葉中花青素組分的分析與鑒定，為茶樹紫色芽葉的發(fā)生機理、高含量花青素茶樹品種的選育、花青素單體藥理與生物學作用的深入研究和利用提供依據。

鑒于周瓊瓊等[7]研究紫芽茶樹在同一時期幼嫩紫芽和成熟綠葉的生化成分差異，進一步證明了茶樹芽葉呈紫色是由其高含量的花青素組分引起的。本實驗在其基礎上研究紫芽茶樹不同季節(jié)主要生化成分變化，探究不同季節(jié)下生化成分的變化規(guī)律，可較全面驗證紫芽茶樹芽葉紫化是由于花青素積累。并且，本研究在Pang等[15]的方法上進一步優(yōu)化茶樹花青素提取方法，為后續(xù)研究茶樹花青素提供可行的提取方法，為茶樹花青素代謝合成途徑奠定基礎，為培育高花青素茶樹品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 供試材料為紫芽茶樹武夷奇種C18-1一芽二葉時期，鮮葉原料采自武夷星茶業(yè)，每個季節(jié)茶樣分成3份。采用120 ℃固樣，并用球磨機磨碎試樣，待測。夏茶取于2016年6月28日，暑茶取于2016年8月28日，秋茶取于2016年9月30日，春茶取于2017年4月6日。

1.1.2 主要儀器與設備 電熱恒溫水浴鍋（常州市人和儀器廠、HWS24型）、紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司、TU-1810）、離心機（上海盧湘儀TDZ5B-WS）、循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司、SHB-Ⅲ型）、電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、通風櫥、球磨機（FRITSCH Pulverisette 23）、分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司、BSA124S）、超純水機（Spring-S20）、快速水分測定儀（sartorious）等。

1.1.3 主要藥品及試劑 碳酸鈉、濃鹽酸、乙醇、甲醇、丙酮、水合茚三酮、堿式乙酸鉛、濃硫酸、福林酚試劑、沒食子酸、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化亞錫、谷氨酸等。

1.2 方法

1.2.1 生化成分測定方法 茶葉中水分測定采用快速水分測定儀進行[16]；茶葉中水浸出物測定參照GB/T 8305-2013《茶 水浸出物》進行；茶葉中咖啡堿含量測定參照GB/T 8312-2013《茶 咖啡堿》進行；茶葉中游離氨基酸含量測定參照GB/T 8314-2008《茶 游離氨基酸》總量進行；茶葉中茶多酚含量測定參照GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》進行。

1.2.2 茶葉中花青素含量測定方法及優(yōu)化 花青素含量測定方法采用Pang等[15]的方法：準確稱取不同季節(jié)茶粉各1.000 g，放入圓底燒瓶中，取20 mL的3%鹽酸乙醇溶液于圓底燒瓶中，在水浴鍋中以60 ℃回流浸提1 h。回流結束后，用3%鹽酸乙醇溶液定容至25 mL。以3%的鹽酸乙醇溶液作為參比液，分別于530 nm和657 nm的波長下測定吸光值。

花青素的計算方法（OD/g，鮮重）：OD=（OD530-0.25伊OD657）/M。

（1）提取溶劑類型的優(yōu)化：設置1%鹽酸甲醇溶液、1%鹽酸乙醇溶液、1%鹽酸丙酮溶液進行比較。鹽酸濃度為75%，甲醇為分析純，乙醇濃度為100%，丙酮為分析純。準確稱取1.000 g茶粉9份，放入圓底燒瓶中，再分別加入20 mL的1%鹽酸甲醇溶液、1%鹽酸乙醇溶液、1%鹽酸丙酮溶液，在60 ℃的條件下回流浸提1 h?；亓鹘Y束后，用相應濃度的不同溶液定容至25 mL。以各自對應的有機溶劑作為參比液，分別于530、657 nm的波長下測定吸光值。

（2）鹽酸乙醇濃度的優(yōu)化：設置1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%等6個濃度的鹽酸乙醇溶液進行比較。準確稱取1.000 g的茶粉18份，放入圓底燒瓶中，再分別加入20 mL的1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%的鹽酸乙醇溶液，在60 ℃的條件下回流浸提1 h?；亓鹘Y束后，用相應濃度的鹽酸乙醇溶液定容至25 mL。以各自對應的有機溶劑作為參比液，分別于530、657 nm的波長下測定吸光值。

（3）浸提時間的優(yōu)化：設置30、60、90 min等3個不同回流浸提時間進行比較。準確稱取1.000 g的茶粉9份，放入圓底燒瓶中，再分別加入20 mL的3%的鹽酸乙醇溶液，在60 ℃的條件下分別回流浸提30、60、90 min。回流結束后，用3%的鹽酸乙醇溶液定容至25 mL。以3%的鹽酸乙醇溶液作為參比液，分別于530、657 nm的波長下測定吸光值。

（4）浸提溫度的優(yōu)化：設置60、70、80、90 ℃等4個不同溫度進行比較。準確稱取1.000 g的茶粉12份，放入圓底燒瓶中，再分別加入20 mL的3%的鹽酸乙醇溶液，在60、70、80、90 ℃的水浴鍋分別回流浸提1 h?；亓鹘Y束后，用3%鹽酸乙醇溶液定容至25 mL。以3%的鹽酸乙醇溶液作為參比液，分別于530、657 nm的波長下測定吸光值。

（5）不同季節(jié)花青素總量的測定：準確稱取不同季節(jié)的茶粉各1.000 g，放入圓底燒瓶中，取20 mL的3%鹽酸乙醇溶液于圓底燒瓶中，在水浴鍋中以80 ℃回流浸提1 h?；亓鹘Y束后，用3%鹽酸乙醇溶液定容至25 mL。以3%的鹽酸乙醇溶液作為參比液，分別于530、657 nm的波長下測定吸光值。

1.3 數據處理

數據采用Microsoft Excel 2010和SPSS17.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 花青素提取優(yōu)化實驗結果分析

2.1.1 提取溶劑對花青素提取效果的影響 從圖1可知，1%鹽酸乙醇溶液提取的花青素含量較高，達（1.607 75±0.08） mg/g。

2.1.2 不同鹽酸乙醇濃度對花青素提取效果的影響 從圖2可知，3%的鹽酸乙醇溶液提取的花青素含量最高，達（1.976 75±0.24） mg/g，其次是4.0%的鹽酸乙醇溶液，提取量為（1.905 80±0.13）mg/g。

2.1.3 不同提取時間對花青素提取效果的影響 從圖3可知，提取時間為60 min時花青素含量最高，為（1.976 75±0.11） mg/g。

小寫字母表示不同季節(jié)之間存在顯著差異（p<0.05）。下同。

2.1.4 不同提取溫度對花青素提取效果的影響 從圖4可知，4個提取溫度下，以溫度為80 ℃時花青素的提取量最高，為（2.188 5±0.14）mg/g。

2.2 紫化茶樹武夷奇種C18-1花青素含量檢測分析

由圖5可知，夏季花青素含量最高，為（3.12±0.03）mg/g，秋季花青素含量最低，為（2.09±0.20）mg/g?；ㄇ嗨睾砍是锛?春季<暑季<夏季遞增趨勢。顯著性分析顯示，夏、暑季花青素含量變化顯著；春、秋季變化不顯著，但是，春、秋季與夏、暑季變化呈極顯著。

大小寫字母表示不同季節(jié)之間存在極顯著（p<0.01）或顯著（p<0.05）差異。

2.3 紫芽茶樹武夷奇種C18-1主要生化成分檢測分析

2.3.1 水浸出物含量變化分析 由表1可知，武夷奇種C18-1水浸出物含量春季最高，為（49.68±0.30）%；夏季最低，為（45.03±0.18）%。水浸出物含量呈夏季<暑季<秋季<春季遞增趨勢。顯著性分析顯示，春季、秋季水浸出物含量變化不顯著，但是，春、秋季與夏、暑季比較呈極顯著，夏季與秋季水浸出物含量變化也呈極顯著。

2.3.2 咖啡堿含量變化分析 由表1可知， 武夷奇種C18-1咖啡堿含量春季最高，為（2.83±0.20）%；夏季最低，為（2.19±0.41）%?？Х葔A含量呈夏季<暑季<秋季<春季遞增趨勢。顯著性分析顯示，夏、暑、秋季咖啡堿含量變化不顯著，春季與夏、暑季咖啡堿含量變化顯著。

2.3.3 游離氨基酸含量變化分析 由表1可知， 武夷奇種C18-1游離氨基酸含量春季最高，為（2.98±0.08）%；夏季最低，為（2.14±0.14）%。游離氨基酸含量呈夏季<暑季<秋季<春季遞增趨勢。顯著性分析顯示，夏、暑季變化不顯著，春季與秋季變化顯著，春、秋季與夏、暑季變化呈極顯著。

2.3.4 茶多酚含量變化分析 由表1可知，武夷奇種C18-1茶多酚含量夏季最高，為（23.95±0.10）%；春季最低，為（21.21±0.35）%。茶多酚含量呈春季<秋季<暑季<夏季遞增趨勢。顯著性分析顯示，春、秋季變化不顯著，但是，春、秋季與夏、暑季變化呈極顯著，夏季與暑季變化也呈極顯著。

3 討論

本研究對提取茶樹花青素總量的條件進行優(yōu)化，結果顯示，稱取1.000 g茶粉溶于20 mL的3%的鹽酸乙醇溶液，在80 ℃水浴中進行回流浸提1 h的條件最佳。花青素含有多個羥基，所以選擇親水性溶劑如甲醇、乙醇、丙酮、稀酸、稀堿等極性較大且能與水互相混溶的有機溶劑較好[17]。雖然鹽酸乙醇的穩(wěn)定性不如鹽酸甲醇，但是乙醇作為有機溶劑，安全度高，使用頻率高，且提取率較高，溶劑殘留較少，同時用鹽酸酸化處理能夠使其pH值始終維持在一個較低的數值，防止在浸提過程中非?；幕ㄇ嗨亟到鈁18]。所以本研究采用鹽酸乙醇溶液來提取花青素。

紫芽種質資源中花青素含量相對一般茶葉較高。其產生和累積離不開茶樹生長狀態(tài)及栽培條件?；ㄇ嗨氐姆e累需要較強的光照和較高的氣溫，故而夏季的花青素含量最高，使芽葉紅紫化明顯；光照較弱、氣溫溫和的春季和秋季，二者的花青素含量相對較低。因為花青素屬于多酚類，與多酚類代謝和糖代謝密切相關。所以花青素含量呈秋季<春季<暑季<夏季遞增趨勢。

茶葉水浸出物即為茶葉中能被熱水溶解的物質[19]，水浸出物的主要成分是水溶性果膠、氨基酸、茶多酚、咖啡堿等[20]。水浸出物含量與茶葉中可溶性物質的量相關，茶湯醇厚與否取決于此。不同季節(jié)茶葉水浸出物有極顯著的差異，可能是由于春季氮素代謝快，作為含氮化合物的咖啡堿、氨基酸等物質含量高，所以水浸出物含量高。夏季高溫、少雨，糖類代謝旺盛，而在此前提下進行了多酚類的代謝。因此夏、暑季茶多酚、可溶性糖的含量較高，但是總水浸出物含量不及春、秋季。水浸出物含量呈夏季<暑季<秋季<春季的遞增趨勢。

咖啡堿作為可溶性含氮化合物，決定著茶葉的品質。春茶多于夏、暑、秋茶。在正常情況下，光照強度和光照量大，有利于碳代謝，但同時對氮化合物代謝的抑制程度也不同。所以光照適宜有利于氮代謝，可以促進咖啡堿的合成。水分和溫度也影響著咖啡堿的合成，春季、秋季光照較弱，溫度適宜，水分較充足，咖啡堿含量高；夏、暑季光照強，高溫少雨，影響氮代謝的進行，因此咖啡堿含量較低。此外，咖啡堿含量也受施肥條件的影響。咖啡堿含量呈夏季<暑季<秋季<春季的遞增趨勢。

氨基酸也是茶湯主要的呈味物質之一，其含量高則成茶具有鮮爽的口感、馥郁的香氣。游離氨基酸的含量呈夏季<暑季<秋季<春季遞增，可能是因為含氮化合物的作用。春季溫濕度適宜，光照相對較弱，氮代謝較快，氮肥供給多，茶樹含氮量高，且春季水分充足，雨水多，從而使氨基酸含量也升高。由于夏、暑季高溫少雨，高光照，蒸騰作用強烈，氮代謝被抑制，氮肥供應量少于春季，且又容易被分解和轉化，造成含量低；而到了秋季，光照強度和日照量相較于夏、暑季低，雨水量較之高。所以，氮代謝又活躍起來，含氮量回升，氨基酸又積累。施肥也影響游離氨基酸的含量。12月初施肥可促進氨基酸含量增多，有利于春茶滋味等；而夏、暑季不施肥減少了氨基酸的合成，致使氨基酸含量減少，形成了不同季節(jié)的差異變化。

茶葉中多酚類含量占干物質量的20%～25%，對成品茶色澤、香氣、滋味等品質的形成有重要影響，影響茶湯口感和色澤[21]。茶多酚含量呈春季<秋季<暑季<夏季的遞增趨勢。夏、暑季光照強烈，日照時間長，兒茶素合成加快，積累多于分解；高溫少雨，導致茶樹體內酶活性增強，有機物質的運輸加快，呼吸強度大，茶樹糖代謝速度快，次級代謝產物多，且空氣濕度較低，水分蒸發(fā)量大，導致茶樹葉片氣孔關閉，CO2進入葉片難度大，光合作用受抑制，因此多酚類積累較多。春、秋兩季，光照強度較夏、暑季弱，日照時間相對較短，氣溫較溫和，雨水充沛，光合作用等活動正常進行，生理機能正常，多酚類正常合成。因此夏、暑季茶多酚含量高于春、秋季。

季節(jié)不同，其環(huán)境條件（光照、溫度、水分等）和施肥情況也不同。光照強度和時長、溫度和水分，影響著光合作用和茶樹的碳氮代謝。光照強，時間長，氮代謝被抑制，碳代謝加快；光照弱，時間短，則相反。高溫少雨則抑制氮代謝，增強碳代謝。因此，作為含氮化合物的咖啡堿及游離氨基酸春季含量最高，夏、暑季含量低；作為碳代謝產物的茶多酚則在夏季達到最高，春、秋季則降低。冬季施肥可促進春季茶樹含氮量增加，提高春茶品質。本研究可為紫化茶樹成品茶的加工提供一定理論依據，可適當地選擇采摘特定季節(jié)下的鮮葉進行加工，滿足生產和市場上的需要。

花青素因其保健功能，近年來被廣大學者所關注，高花青素茶樹種質也因其特異性而成為研究熱點[6-7]。羅正飛等[22]得到“紫鵑”茶中花青素的最佳醇提條件為：70%乙醇溶劑、回流提取30 min、回流溫度80 ℃、研究料液比1：10，但未對提取溶劑做出研究優(yōu)化。本研究選取了鹽酸甲醇、鹽酸乙醇及鹽酸丙酮來做提取優(yōu)化。李智等[14]采用酸性甲醇作為提取溶劑。甲醇具有一定毒性，考慮到其在食品中的適用性，因此本研究采用酸性乙醇溶液作為提取溶劑。本研究優(yōu)化的花青素提取方法能有效提取茶葉花青素，可為后續(xù)研究提供一定參考。

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