袁光宇　謝體波　龔維瑤

摘要[目的]建立凍雞肉中金黃色葡萄球菌的LAMP檢測(cè)方法。[方法]根據(jù)金黃色葡萄球菌特異性耐熱核酸酶基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立LAMP檢測(cè)方法，并用于檢測(cè)采購(gòu)自貴陽市各大超市的凍雞肉樣品。[結(jié)果]設(shè)計(jì)合成的2對(duì)引物和建立的LAMP方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌具有良好的特異性，反應(yīng)體系的靈敏度為65 CFU/mL。檢測(cè)采購(gòu)自貴陽市各大超市和經(jīng)人為污染的264份凍雞肉樣品分別用LAMP方法檢測(cè)，并用國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)驗(yàn)證，其特異性為95.2%，準(zhǔn)確度為97.3%。[結(jié)論]該研究建立的方法為實(shí)現(xiàn)在凍雞肉中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞金黃色葡萄球菌；LAMP；檢測(cè)方法；凍雞肉

中圖分類號(hào)S851.34+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）25-0162-02

Establishment of Rapid Detection Method of Staphylococcus aureus LAMP in Frozen Chicken

YUAN Guangyu， XIE Tibo，GONG Weiyao et al

（Guizhou Kwinbon Science and Technology for Food Safety Co.，Ltd.，Guiyang，Guizhou 550009）

Abstract[Objective] The research aimed to establish a LAMP method for detection of S. aureus in frozen chicken. [Method] Two pairs of primers were designed based on the nuc gene sequence of S. aureus. A LAMP detection method was established and used to detect frozen chicken samples from major supermarkets in Guiyang.[Result]Two pairs of primers and the established LAMP method had good specificity for the detection of S. aureus. The sensitivity was 65 CFU/mL. 264 frozen chicken samples purchased from major supermarkets in Guiyang and polluted by humans were detected by LAMP method and verified by national standard method. The specificity was 95.2% and the accuracy was 97.3%.[Conclusion]The method established in this study laid a good foundation for rapid detection of S. aureus in frozen chicken.

Key wordsStaphylococcus aureus；LAMP；Detection method；Frozen chicken

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）簡(jiǎn)稱金葡菌，是一種革蘭氏陽性需氧或兼性厭氧菌，廣泛分布于人類生活環(huán)境中，多寄生在人和動(dòng)物的表皮、呼吸道、消化道及化膿性傷口[1-2]。金葡菌無運(yùn)動(dòng)能力，不產(chǎn)生芽孢，最適生長(zhǎng)環(huán)境為溫度37 ℃、pH 7.4，能夠適應(yīng)10%的高鹽環(huán)境[3]。金葡菌本身不具致病性，但其在繁殖過程合成腸毒素，從而導(dǎo)致食物中毒，出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀[4-5]。食品在生產(chǎn)、加工過程中的不嚴(yán)格管控，極易受該菌污染。

在國(guó)內(nèi)，由金葡菌導(dǎo)致的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生[6-7]。同時(shí)，凍品被檢測(cè)出金葡菌污染也時(shí)有報(bào)道[8]。目前，對(duì)金葡菌的主要檢測(cè)方法有國(guó)標(biāo)方法、PCR、免疫檢測(cè)等[9-10]。各檢測(cè)方法各有所長(zhǎng)，國(guó)標(biāo)方法準(zhǔn)確檢測(cè)率100%，但操作要求無菌，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無法實(shí)現(xiàn)快速出結(jié)果；免疫檢測(cè)方法雖然時(shí)間較短，但受到靈敏度的制約[9]；PCR方法也需要精密儀器實(shí)現(xiàn)控制溫度變化，并且靈敏度也較低[11]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）由Notomi等[12]于2000年開發(fā)的一種基于PCR的DNA恒溫?cái)U(kuò)增方法，其具有特異性高、靈敏度高、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，被應(yīng)用在微生物、寄生蟲的檢測(cè)等領(lǐng)域[13-15]。筆者根據(jù)金葡菌的特異性nuc基因序列設(shè)計(jì)引物，實(shí)現(xiàn)在凍雞肉中金葡菌的快速檢測(cè)，以期為凍品中金葡菌的快速檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；Isothermal Mix、熒光等溫?cái)U(kuò)增儀GENEⅡ型購(gòu)自O(shè)ptiGene公司；試驗(yàn)菌株信息為金黃色葡萄球菌（CGMCC 1.282）、大腸桿菌（CICC 10003）、枯草芽孢桿菌（CGMCC 1.821）、單增李斯特菌（CMCC 54003）、傷害沙門氏菌（CMCC 50071），由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供；凍雞肉購(gòu)自貴陽市各大超市。

1.2研究方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)。

根據(jù)在GenBank中查詢到金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶（nuc）基因序列（GenBank DQ507382.1），分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物，引物序列如表1所示。

1.2.2LAMP反應(yīng)體系的建立。

試驗(yàn)菌株按試劑盒方法步驟提取DNA，并測(cè)定核酸濃度。以提取的DNA作為模板，建立20 μL反應(yīng)體系。PCR管中依次加入等溫?cái)U(kuò)增混合液10 μL、引物F3/B3（0.2 μmol/L）1 μL、引物FIP/BIP（0.8 μmol/L）1 μL、DNA模板（50 μg/L）1 μL、ddH2O 7 μL。將反應(yīng)體系混合均勻，放入熒光等溫?cái)U(kuò)增儀，65 ℃擴(kuò)增45 min。

1.2.3LAMP檢測(cè)方法的特異性和靈敏度。

為驗(yàn)證設(shè)計(jì)的引物序列經(jīng)LAMP檢測(cè)金葡菌nuc基因序列特異性，將菌株金黃色葡萄球菌（CGMCC 1.282）、大腸桿菌（CICC 10003）、枯草芽孢桿菌（CGMCC 1.821）、單增李斯特菌（CMCC 54003）、傷害沙門氏菌（CMCC 50071）按適宜培養(yǎng)條件液體培養(yǎng)過夜，按試劑盒方法提取細(xì)菌基因組DNA，測(cè)定DNA濃度，定量至50 μg/L。以細(xì)菌基因組DNA作為模板，用“1.2.2”建立的方法驗(yàn)證特異性。

將金葡菌按10倍梯度稀釋至10-8，國(guó)標(biāo)方法（GB 4789.10—2016）進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定金葡菌菌活數(shù)。將各稀釋菌液煮沸、離心，取1 μL作為模板，用于驗(yàn)證LAMP方法的靈敏度。

1.2.4凍雞肉中金葡菌的檢測(cè)。

將采購(gòu)自各大超市的金葡菌陰性凍雞肉，取50 g接種已知濃度的金葡菌進(jìn)行污染，作為陽性樣本，以不添加金葡菌株凍雞肉作為陰性樣本，共計(jì)264份。分別用國(guó)標(biāo)方法（GB 4789.10—2016）和LAMP方法盲檢。

2結(jié)果與分析

2.1LAMP檢測(cè)的特異性

經(jīng)熒光等溫?cái)U(kuò)增儀擴(kuò)增金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、傷害沙門氏菌5株致病菌基因組DNA，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌熒光信號(hào)呈指數(shù)增加，其余4株均未檢測(cè)到熒光信號(hào)的變化，表明設(shè)計(jì)的nuc基因序列用于LAMP檢測(cè)金黃色葡萄球菌特異性高。

2.2LAMP檢測(cè)的靈敏度

金葡菌經(jīng)一系列稀釋后，對(duì)各稀釋度利用建立的LAMP檢測(cè)熒光信號(hào)，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，5個(gè)梯度（32、47、65、82、100 CFU/mL）中，隨著時(shí)間增加32、47 CFU/mL熒光信號(hào)均未變化，65 CFU/mL在30 min左右開始檢測(cè)到熒光信號(hào)增強(qiáng)，82、100 CFU/mL均在反應(yīng)開始較短時(shí)間內(nèi)熒光信號(hào)開始增強(qiáng)。因此，金葡菌靈敏度能夠達(dá)65 CFU/mL，說明試驗(yàn)建立的LAMP方法具有較高的靈敏度。

2.3LAMP檢測(cè)凍雞肉

將采購(gòu)自貴陽市各大超市凍雞肉和人為污染凍雞肉，根據(jù)建立的LAMP和國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)金葡菌，結(jié)果顯示，測(cè)出陽性樣品分別為L(zhǎng)AMP方法138份，國(guó)標(biāo)方法145份；陰性樣本分別為L(zhǎng)AMP方法126份，國(guó)標(biāo)方法119份。分析結(jié)果可知建立的LAMP檢測(cè)特異性為95.2%，準(zhǔn)確度為973%。

3討論與結(jié)論

凍雞肉因其長(zhǎng)期存放在低溫環(huán)境，并不適于微生物的生長(zhǎng)需求，因此在受到微生物污染后，短時(shí)間內(nèi)并不會(huì)出現(xiàn)明顯的變質(zhì)，但仍然存在微生物污染后的潛在危險(xiǎn)。因此建立一種快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法相當(dāng)重要。金葡菌是食品污染的主要菌之一，其檢測(cè)方法中國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)主要受時(shí)間的制約，每次檢測(cè)約需48 h，耗時(shí)耗力[16]。PCR方法受靈敏度的限制，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的其檢測(cè)限多在103～105 CFU/mL[17-18]。而LAMP方法很好地避免了以上2種方法存在的問題，能夠?qū)崿F(xiàn)凍品更快速準(zhǔn)確的檢測(cè)需求。

該研究利用金葡菌nuc基因作為檢測(cè)基因，建立一種LAMP技術(shù)快速檢測(cè)凍雞肉中金葡菌的方法。根據(jù)基因序列（GenBank DQ507382.1）設(shè)計(jì)的2對(duì)引物，建立的LAMP檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、傷害沙門氏菌的基因組DNA，以驗(yàn)證設(shè)計(jì)的2對(duì)引物檢測(cè)金葡菌特異性。為獲取足量細(xì)菌基因組DNA，檢測(cè)前對(duì)5株菌株分別進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增細(xì)菌經(jīng)試劑盒方法提取，測(cè)定核酸蛋白濃度并統(tǒng)一稀釋至50 μg/L用于LAMP檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，5株菌株僅金葡菌熒光信號(hào)呈指數(shù)增強(qiáng)，表明nuc基因作為金葡菌檢測(cè)具有特異性。金葡菌菌液經(jīng)一系列稀釋，菌液分別用于LAMP檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度、國(guó)標(biāo)方法確定活菌數(shù)。檢測(cè)結(jié)果顯示，建立的LAMP方法靈敏度為65 CFU/mL。該研究建立的LAMP方法與國(guó)標(biāo)方法分別盲檢采購(gòu)自貴陽市各大超市凍雞肉及人為污染的凍雞肉264份，由結(jié)果可知LAMP檢測(cè)特異性為95.2%，準(zhǔn)確度為973%，表明該研究建立的LAMP快速檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果可靠，準(zhǔn)確度、特異度高。

參考文獻(xiàn)

[1] KHAN S，RASHEED F，ZAHRA R.Genetic polymorphism of agr locus and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus at two hospitals in Pakistan[J].Pak J Med Sci，2014，30（1）：172-176.

[2] GITAU G K，BUNDI R M，VANLEEUWEN J，et al.Evaluation of PetrifilmsTM as a diagnostic test to detect bovine mastitis organisms in Kenya[J].Trop Anim Health Prod，2013，45（3）：883-886.