孫盈　李萍萍　付為國

摘要[目的]研究蘆葦根系及根際土中酚酸類化感物質(zhì)的水分響應(yīng)特性。[方法]分析蘆葦中主要酚酸類化感物質(zhì)的水環(huán)境響應(yīng)特性，采用高效液相色譜法對不同水分環(huán)境下蘆葦根系及根際土中酚酸類物質(zhì)進行分離和鑒定。[結(jié)果]從蘆葦根系及根際土中均分離出沒食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、水楊酸和苯甲酸這8種酚酸類物質(zhì)，且二者中分離出的8種酚酸類物質(zhì)含量與蘆葦根際土相對含水量均呈顯著負相關(guān)，即隨著根際土相對含水量的上升，酚酸類物質(zhì)的含量均呈現(xiàn)下降趨勢，且各種酚酸類物質(zhì)對水分的響應(yīng)趨勢均可用線性方程較好擬合。在蘆葦根系中，香豆酸、阿魏酸和沒食子酸這3種酚酸類物質(zhì)水分響應(yīng)較為明顯，在蘆葦根際土中，香豆酸和阿魏酸對蘆葦腐解土的水分響應(yīng)較為明顯。[結(jié)論]香豆酸和阿魏酸是控制蘆葦種群和虉草種群競爭平衡狀態(tài)較為關(guān)鍵的2種酚酸類化感物質(zhì)。

關(guān)鍵詞蘆葦；酚酸；根系；根際土；化感作用；水分響應(yīng)

中圖分類號S181文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）25-0071-04

Study on the Moisture Response of Phenolic Acids in Phragmites australis Root and Rhizosperic Soil

SUN Ying1，LI Pingping2，F(xiàn)U Weiguo1，2

（1.Agricultural Engineering Research Institute， Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013；2.Cooperative Innovation Center of Southern Modern Forestry，Nanjing Forestry University，Nanjing，Jiangsu 210037）

Abstract[Objective]To study the moisture response of phenolic acids in Phragmites australis root and rhizosperic soil. [Method] The responses to moisture of the main phenolic allelochemicals in the P. australix communis were analyzed， and high performance liquid chromatography （HPLC） was used to separate and identify phenolic acids substances in P. australix root and rhizosperic soil with different moisture content conditions. [Result] 8 kinds of phenolic acids were separated and identified from both P. australix root and rhizosperic soil which are gallic acid， coumaric acid， vanillic acid， syringic acid， pcoumaric acid， ferulic acid， salicylic acid， and benzoic acid . There was a significant linear negative correlation between every identified phenolic acid and the relative moisture content of P. australis rhizosperic soil， which is， as an increase in the relative moisture content of P. australis decomposed soil， content of every identified phenolic acid showed a downward trend， and the response curve of content of every identified phenolic acid to the relative moisture content of P. australix root and rhizosperic soil can be fitted well with a linear equation. Responses of coumarinic acid， gallic acid and ferulic acid to rhizosperic soil moisture were most obvious among P. australix root， and responses of coumarinic acid and ferulic acid to rhizosperic soil moisture were most obvious among P. australix rhizosperic soil. [Conclusion]The results indicated that coumaric acid and ferulic acid were the key to control the balance of P. australis population and P. arundinacea population.

Key wordsPhragmites australis；Phenolic acids；Root；Rhizosperic soil；Allelopathy；Response to moisture

化感作用在植物中廣泛存在，各種植物通過向外界環(huán)境釋放化感物質(zhì)從而直接或間接地對同種或異種植物產(chǎn)生有害或有益的作用[1]。植物根分泌的化學物質(zhì)是化感物質(zhì)的重要組成之一，根分泌物是指那些健康完整的活體植物的根系組織向土壤中釋放的化學物質(zhì)，主要分為三大類：第一類為大分子有機物，包括糖、蛋白質(zhì)、酶和凝膠等；第二類為小分子酸、酚和酮等；第三類為生長激素、黃酮和甾類等[2]。Birkett等[3]研究得出根際土壤（rhizosperic soil）是根分泌物及其轉(zhuǎn)化分解產(chǎn)物的儲存庫，通過根分泌釋放的化感物質(zhì)直接進入土壤中。有些植物釋放植物毒素并對其他植物種產(chǎn)生影響，其化學物質(zhì)須通過土壤媒介移動到目標植物的根部，由根分泌到土壤中的這些化感物質(zhì)經(jīng)歷了不同類型的遷移和生物降解[4]。在對植物根系分泌物的化感作用進行探索時，應(yīng)從根系及根際土壤2個部分著手。

蘆葦（Phragmites australis）是濕地常見的根莖類禾本科植物，無性繁殖能力強，常在棲息地形成單優(yōu)群落[5]。相關(guān)研究證實蘆葦是一種強化感植物，對羊角月牙藻、雷氏衣藻和水華微囊藻等藻類以及一枝黃花（ Solidago canadensis Linn）、互花米草（ Spartina alterniflora Lois）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、小飛蓬（Conyza canadensis L.）和田菁（Sesbania cannabina）等高等植物均有不同程度的化感作用[6-10]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在長江下游的鎮(zhèn)江濱江濕地，從遠離岸邊的淺灘到近岸，隨著基底抬升和基底土壤含水量下降，存在由裸灘→虉草（Phalaris arundinacea）群落→虉草-蘆葦群落→蘆葦群落的植被演替群落過程[11]，即存在隨著濱江濕地基底抬升，蘆葦種群逐漸完全替代虉草種群的現(xiàn)象。蘆葦和虉草同為有較強去污能力的濕地植物，且二者具有周年互補性，因此2個物種被廣泛用來構(gòu)建人工濕地植物群落[12]。但當蘆葦-虉草人工濕地運行若干年后，蘆葦種群通?？赏耆娲埐莘N群，導致人工濕地的去污功能受到削弱[13]，而事實上，這類人工濕地在運行過程中，常因一些固體顆粒物的長期淤積導致基底逐漸抬升以及土壤含水量下降。因此，在自然濕地和人工濕地中，均出現(xiàn)隨著基底土壤含水量下降，濕地蘆葦種群逐漸替代虉草種群的現(xiàn)象。鑒于蘆葦是一種強化感植物以及化感作用具有強烈的“隨著土壤水分降低，化感抑制效應(yīng)增加”的水環(huán)境響應(yīng)特性[14]，有理由推斷：蘆葦種群對虉草種群的逐步替代過程正是蘆葦對虉草化感抑制效應(yīng)隨土壤含水量降低而逐漸增強的過程。

化感物質(zhì)的釋放途徑包括雨霧淋溶、植物揮發(fā)、植株殘體降解和根系分泌等[15]，與土壤水分含量相關(guān)性較高的釋放途徑只有進入土壤中的植株殘體降解和根系分泌2種。尹淇淋[12]研究了濱江濕地的野生蘆葦根系分泌物對虉草的化感抑制效應(yīng)及其水環(huán)境響應(yīng)特性，并用高效液相色譜法（HPLC）分離和鑒定出根系及根際土壤中所含的香豆酸、香草酸、沒食子酸、苯甲酸、丁香酸、阿魏酸和水楊酸7種酚酸物質(zhì)，但濱江濕地環(huán)境較為復(fù)雜，土壤中植物殘留繁多，試驗結(jié)果受不確定因素影響較大，且其選取的酚酸對照品范圍較小。筆者在其研究的基礎(chǔ)上，排除其他植物殘體的干擾，從濱江濕地取蘆葦根進行桶栽培養(yǎng)，選取常見的10種具有化感效應(yīng)的酚酸物質(zhì)，利用高效液相色譜法對蘆葦根及根際土壤中各酚酸類物質(zhì)進行分離、鑒定和測定，不僅可進一步研究蘆葦對虉草化感效應(yīng)的水環(huán)境響應(yīng)特性，而且也可探索出維持虉草蘆葦穩(wěn)定共存的濕地基底土壤含水量范圍，進而為虉草蘆葦人工濕地的群落穩(wěn)定管理提供理論支持和技術(shù)指導。

1材料與方法

1.1材料

蘆葦根：2015年10月，于鎮(zhèn)江濱江濕地挖取大小相近蘆葦根。試驗用土：自濱江濕地光灘采取一定量新淤積的泥土，曬干、磨碎、去雜、過篩。

1.2方法

1.2.1蘆葦栽培試驗。

將泥土等體積置于12個塑料桶（上徑62 cm、下徑48 cm、高52 cm）。將等數(shù)量蘆葦根栽于12個塑料桶中，期間設(shè)置T1、T2、T3和T4共4個水分處理，利用稱重法將4個處理的相對含水量分別維持在65%～70%、75%～80%、85%～90%和95%～100%，每個處理3次重復(fù)。 2017年7月15 日，對各處理蘆葦根和根際土壤中酚酸類物質(zhì)進行分離、鑒定和測定，后取其均值分析。

1.2.2蘆葦根及根際土壤中酚酸類物質(zhì)的 HPLC分析。

1.2.2.1儀器與試劑。

Thermo UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（ Thermo Fisher公司）；SHZ-D（Ⅲ）真空泵（河南予華儀器有限公司）；Neofugo 18R高速離心機（力康生物醫(yī)療科技）；CHA-S氣浴恒溫振蕩器（金壇榮華儀器制造有限公司）；BSA224S電子分析天平（萬分之一，德國Sartorius）。

標準品沒食子酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸、香豆酸、丁香酸、對香豆酸、對羥基苯甲酸、水楊酸、咖啡酸，均購自上海晨易生物公司；甲醇為色譜級，水為超純水。

1.2.2.2色譜條件。

色譜柱為Thermo C18（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相A為甲醇；流動相B為1%乙酸水溶液；UV檢測波長為280 nm；柱溫為30 ℃；梯度洗脫程序：0～8 min，40%A；>8～19 min，35%A；>19～30 min，10%A；流速為1.0 mL/min。

1.2.2.3標準溶液配制。

精密稱取上述10種酚酸標準品各1 mg，置于10 mL 容量瓶中，加50%甲醇水溶液溶解并定容，得1 mg/mL的酚酸標準混合液，依次用50%甲醇水溶液稀釋2、10、50、100倍配制成系列標準樣品混合溶液。同時準確稱取 10種酚酸標準品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液溶解并定容，得1 mg/mL的單一種酚酸溶液，用于判定每種酚酸標準品的出峰時間，即在混合標準品中的出峰位置。

1.2.2.4蘆葦根與根際土樣品溶液的制備。

每份蘆葦根和根際土壤樣品均取10 g，置于錐形瓶中，加入50%甲醇水溶液100 mL，常溫下振蕩提取6 h，后上離心機分離取上清液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（真空，30 ℃）濃縮至1 mL，過0.22 μm有機過濾膜，制成供試樣品溶液。

1.3統(tǒng)計分析

對蘆葦根及根際土壤中酚酸物質(zhì)含量與土壤相對含水量的響應(yīng)關(guān)系進行線性回歸分析。運用Excel 2007及SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1標準品和供試樣品色譜圖

對10種酚酸類物質(zhì)標準樣品進行最大吸收光譜掃描，掃描波長為190～400 nm。分析不同酚酸類物質(zhì)的最大吸收光譜，10種酚酸類物質(zhì)在280 nm 左右均有較大吸收峰，因此，選取280 nm作為酚酸類物質(zhì)的定量檢測波長。由于酚酸類物質(zhì)中的酚羥基與羧基在水溶液中易發(fā)生電離，極性增強，在固定相上會形成雙重保留，使色譜峰拖尾嚴重，加入適量酸性調(diào)節(jié)劑，可使多酚的電離受到一定抑制，極性減弱，增強其在固定相上的保留，使分離效果和峰型得到改善[16]。采用乙酸作為流動相的酸性調(diào)節(jié)劑，其濃度對酚酸類物質(zhì)的出峰時間和峰型有一定的影響。分別考察了0.5%～2.0%濃度乙酸水溶液對10種酚酸類物質(zhì)的分離效果，最終選擇1.0%乙酸水溶液。采用等度洗脫時，各峰分離不理想，采用梯度洗脫后分離較好，經(jīng)多次梯度洗脫條件優(yōu)化，最理想洗脫條件為0～8 min，40%甲醇；>8～19 min，35%甲醇；>19～30 min，10%甲醇。按照方法提供的液相色譜分離和分析條件，分別吸取標準品溶液和蘆葦根系、根際土壤供試樣品溶液各10 μL，自動進樣器進樣，分析結(jié)果如圖1所示。在上述色譜條件下，均能得到較好的分離、峰型良好、保留時間穩(wěn)定，蘆葦根系和蘆葦根際土中均含有沒食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、水楊酸和苯甲酸這8種酚酸類物質(zhì)。

2.2蘆葦根系及蘆葦根際土中酚酸類物質(zhì)水分響應(yīng)關(guān)系

將已逐級稀釋配制的10種酚酸混合液分別進樣10 μL，以各種酚酸濃度x（μg/mL）為橫坐標，其峰面積值S（mAU）為縱坐標繪制標準曲線，計算得到10種酚酸物質(zhì)的線性回歸方程、判定系數(shù)及線性范圍，以儀器信噪比（S/N≥3）確定 10 種酚酸物質(zhì)的最低檢出限（表1）。10種酚酸物質(zhì)的線性回歸方程判定系數(shù)均達0.999 0以上，在0.01水平極顯著相關(guān)，因此適用于對蘆葦腐解土中酚酸類物質(zhì)的HPLC定量計算分析。

根據(jù)以上各標準曲線的線性回歸方程，計算出不同處理下蘆葦根部及根際土壤樣品中各酚酸物質(zhì)的含量。進而將各酚酸類物質(zhì)含量與其對應(yīng)蘆葦根際土壤的相對含水量進行線性回歸擬合，得出蘆葦根部各酚酸物質(zhì)擬合方程：香豆酸（y=-0.311 1x+54.416 0，R2=0.967 6）、阿魏酸（y=-0.443 1x+50.877 0，R2=0.959 8）、沒食子酸（y=-0.202 6x+24.085 0，R2=0.945 8）、苯甲酸（y=-0.123 4x+15.764 0，R2=0.959 8）、對香豆酸（y=-0.044 7x+7.618 2，R2=0.981 9）、丁香酸（y=-0.022 6x+3.571 2，R2=0.948 9）、香草酸（y=-0.031 3x+4792 5，R2=0.979 8）、水楊酸（y=-0.098 0x+11.837 0，R2=0982 2）；蘆葦根際土壤各酚酸物質(zhì)擬合方程：香豆酸（y=-0.168 0x+23.961 0，R2=0.941 3）、阿魏酸（y=-0.443 1x+50.877 0，R2=0.959 8）、沒食子酸（y=-0.202 6x+24.085 0，R2=0.945 8）、苯甲酸（y=-0.123 4x+15.764 0，R2=0.959 8）、對香豆酸（y=-0.044 7x+7.618 2，R2=0.981 9）、丁香酸（y=-0.022 6x+3.571 2，R2=0.948 9）、香草酸（y=-0.031 3x+4792 5，R2=0.979 8）、水楊酸（y=-0.098 0x+11.837 0，R2=0.982 2），蘆葦根部及根際土壤中各酚酸物質(zhì)擬合見圖2。

3結(jié)論與討論

研究表明，蘆葦根系及根際土中存在沒食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、水楊酸和苯甲酸這8種酚酸類物質(zhì)，且在蘆葦根系及根際土中這8種酚酸類物質(zhì)含量與其土壤相對含水量均呈顯著負相關(guān)，即隨著土壤相對含水量的上升，蘆葦根系及根際土中酚酸類物質(zhì)均呈現(xiàn)下降趨勢，不同酚酸類物質(zhì)的含量與腐解土相對含水量的關(guān)系可用線性方程加以擬合。蘆葦根系及根際土中不同種類酚酸物質(zhì)對腐解土中的水分響應(yīng)強度存在較大差異，由各酚酸類物質(zhì)對水分擬合方程的斜率判定，在蘆葦根系中香豆酸、阿魏酸和沒食子酸對土壤相對含水量的響應(yīng)較為明顯，在蘆葦根際土中香豆酸和阿魏酸對土壤相對含水量的響應(yīng)較為明顯。由蘆葦根系及根際土中各酚酸類物質(zhì)含量的差異可知，在蘆葦根系中香豆酸、阿魏酸、沒食子酸在8種酚酸物質(zhì)中含量較高，在蘆葦根際土中香豆酸和阿魏酸含量明顯高于其余6種酚酸物質(zhì)。

綜上分析，在對蘆葦-虉草人工濕地進行管理時，為了保持蘆葦種群與虉草種群長期競爭共存穩(wěn)定，可通過調(diào)控濕地土壤中水分含量，重點調(diào)控蘆葦根系和根際土中水分響應(yīng)均較強且含量較高的香豆酸和阿魏酸的化感抑制強度，從而避免出現(xiàn)蘆葦種群代替虉草種群的現(xiàn)象，防止虉草-人工濕地去污功能的喪失。

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