郭春霞

摘要[目的]研究4類重慶柑橘乙醇提取物的類黃酮成分及其體內(nèi)外抗氧化活性。[方法]以4種重慶產(chǎn)區(qū)柑橘果實（梁平柚、奉節(jié)臍橙、萬州大紅袍紅橘和潼南尤力克檸檬）為研究材料，利用Xevo G2-S Qtof高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜儀中的超高效液相色譜儀（Ultra-performance liquid chromatography with a photodiode array detector，UPLC-PDA）對柑橘果皮和果肉的乙醇提取物中主要的10種類黃酮（橙皮苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、地奧司明、橘皮素、川陳皮素、圣草次苷、甜橙黃酮、異橙黃酮和山柰酚）進(jìn)行了定性和定量分析，并用3種體外抗氧化測定方法（DPPH、ABTS、FRAP）評價柑橘果實乙醇提取物的抗氧化活性。同時，以釀酒酵母BY4742菌株為試驗?zāi)Ｐ?，檢測用低、中、高濃度的4類柑橘果實乙醇提取物處理后酵母菌胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量。[結(jié)果]不同柑橘、同種柑橘不同部位的類黃酮種類和含量都存在差異。總體而言，柑橘果皮類黃酮物質(zhì)的種類與總含量高于果肉，果皮提取物的內(nèi)外抗氧化能力高于果肉提取物。其中，梁平柚果實中含量最高的是柚皮苷，奉節(jié)臍橙、萬州大紅袍紅橘和潼南尤力克檸檬果實提取物中含量較高的是橙皮苷。此外，圣草次苷大量存在于潼南尤力克檸檬果實中，川陳皮素大量存在于萬州大紅袍紅橘中，蕓香柚皮苷大量存在于奉節(jié)臍橙中，山柰酚主要分布于梁平柚果皮中，地奧司明主要分布于檸檬和柚子的果肉中。[結(jié)論]奉節(jié)臍橙具有較好的營養(yǎng)價值。與其他3種柑橘果肉相比，奉節(jié)臍橙果肉含有最高的類黃酮含量、綜合抗氧化活性和較高的活性氧清除能力。

關(guān)鍵詞 柑橘；乙醇提取物；類黃酮；活性氧；抗氧化；重慶

中圖分類號 TS207 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）22-0149-05

Abstract[Objective]The research aimed to study the flavonoids and the antioxidative activity in vitro of four kinds of Chongqing citrus extracts.[Method]Four kinds of Citrus in Chongqing producing area （Liangping pomelo， Fengjie navel orange， Wanzhou Dahongpao red tangerine and Tongnan Eureka lemon） were used as materials to qualitatively and quantitatively analyze the main ten kinds of flavonoids （Hesperidin， Narirutin， Naringin， Diosmin， Tangeritin， Nobiletin， Eriocitrin， Sinensetin， Isosinensetin and Kaempferol） in their ethanol extracts by applying the ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole timeofflight mass spectrometry. Three antioxidant assays （DPPH， ABTS， FRAP） were used to evaluate the antioxidant activity of ethanol extracts from the peel/flesh of the four Citrus.At the same time， the Saccharomyces cerevisiae BY4742 strain was used as the experimental model to detect the content of reactive oxygen species （ROS） in yeast cells after treating by the ethanol extracts of four Citrus with low， medium and high concentrations.[Result]There were differences in the types and contents of flavonoids in different Citrus and different parts of the same Citrus.Overall， the species and total content of flavonoids in Citrus pericarp were higher than that of pulp， and the pericarp extracts had higher in vitro antioxidant capacity than the pulp extract. Among them， Liangping pomelo had high content of naringin， while Fengjie navel orange， Wanzhou Dahongpao red tangerine and Tongnan Eureka lemon fruit extract had high content of hesperidin. In addition， a large number of eriocitrin， nobiletin and narirutin were existed in Tongnan Eureka lemon， Wanzhou Dahongpao red tangerine and Fengjie navel orange， respectively. The kaempferol was specific in the peel of Liangping pomelo， and diosmin was specially distributed in the pulp of lemons and grapefruit.[Conclusion]Compared with the other three kinds of Citrus pulp， Fengjie navel orange pulp contains the highest flavonoids content and comprehensive antioxidant activity， and high reactive oxygen scavenging capacity.

Key words Citrus；Ethanol extract；Flavonoids；Reactive oxygen species；Antioxidant activity；Chongqing

我國是柑橘屬植物最重要的起源地，擁有豐富的柑橘資源[1-2]。柑橘作為類黃酮含量豐富的水果之一，具有重要的的營養(yǎng)、保健、醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)價值[3-5]。目前已從柑橘中鑒定出超過60種類黃酮物質(zhì)，主要是黃烷酮類、黃酮、黃酮醇和花色苷[6]，其具有重要的抗氧化活性[7]?？寡趸钚允侵干锘钚晕镔|(zhì)能有效地清除體內(nèi)多余的自由基，防止自由基對生物大分子的氧化損傷，維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)與功能的能力。抗氧化活性為柑橘果實的重要品質(zhì)因子之一，對人體健康具有重要意義[5]。

目前，對水果和蔬菜中各種營養(yǎng)和活性物質(zhì)的研究已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者共同關(guān)注的重大科學(xué)問題[8-9]，也是園藝學(xué)研究的熱點問題和發(fā)展方向[3，8，10]。國內(nèi)外有關(guān)柑橘屬植物營養(yǎng)和活性物質(zhì)的研究已涉到資源評價（種類和含量）、活性成分的提取分離技術(shù)、新物質(zhì)的鑒定、重要成分代謝合成調(diào)控、不同成分生物活性評價、生物活性的影響因素（結(jié)構(gòu)與活性、遺傳、環(huán)境、采后、加工）、人類重大慢性疾病（肥胖與糖尿病、心血管疾病、各種癌癥）防治、不同活性物質(zhì)間的互作以及生物活性物質(zhì)的科學(xué)利用，如抑制微生物、食品保鮮、凈化環(huán)境、納米材料制作等各個方面[3]。

重慶作為我國唯一的柑橘非疫區(qū)和農(nóng)業(yè)部《中國柑橘優(yōu)勢區(qū)域規(guī)劃》“長江中下游柑橘優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)帶”核心區(qū)，在全國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展中具有重要的作用，柑橘產(chǎn)業(yè)已成為加快重慶農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整及促進(jìn)該市農(nóng)民增收的重要產(chǎn)業(yè)[3]。而針對重慶產(chǎn)區(qū)柑橘果實的相關(guān)分析與活性評價還比較欠缺。為此，筆者以梁平柚、奉節(jié)臍橙、萬州大紅袍紅橘和潼南尤力克檸檬4個重慶地區(qū)的特色柑橘品種為研究材料，探討其果實乙醇提取物的類黃酮成分及其體內(nèi)外抗氧化活性，以期進(jìn)一步為重慶柑橘資源的分析與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。該試驗所用的4類柑橘果實于2016年12月采自重慶梁平、奉節(jié)、萬州和潼南。在果實成熟季節(jié)，隨機(jī)選擇樹勢相對一致的3株樹，采摘樹冠外圍中上部果實大小、成熟度相對一致、無病蟲害的果實約20個。具體的樣品信息如表1所示。

1.1.2 酵母菌株。野生型釀酒酵母菌株BY4742（ATCC 201389TM）（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection）。

1.1.3 試劑。類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品[橙皮苷（Hesperidin）、柚皮蕓香苷（Narirutin）、柚皮苷（Naingin）、地奧司明（Diosmin）、橘皮素（Tangeretin）、川陳皮素（Nobiletin）、圣草次苷（Eriocitrin）、甜橙黃酮（Sinensetin）、異橙黃酮（Isosinensetin）、山柰酚（Kaempferol）]，L-氨基酸，酵母氮源，無氨基酸（YNB），硫酸銨，蛋白胨，瓊脂和酵母提取物，H2DCFDA，2，4，6-三吡啶基-s-三嗪（TPTZ），2，2′-（ABTS），1，1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH），二甲亞砜（DMSO），以上所有試劑均購自西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich，上海）。YPD肉湯和其他化學(xué)品來自索萊寶生物技術(shù)有限公司（北京）。

1.1.4 儀器與設(shè)備。Xevo G2-S Qtof高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；全波長掃描式多功能酶標(biāo)儀（Varioskan Flash，Thermo，USA）；Lambd 25型紫外/可見分光光度計（美國PerkinElmer公司）； RE-52A/RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；小型粉碎機(jī)（北京興時利和科技發(fā)展有限公司，RT-04）；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，Centrifuge 5810R，Germany）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；HVE-50 型全自動高壓滅菌鍋（江蘇省科學(xué)器材有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（成都盛德先華科貿(mào)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1

樣品預(yù)處理。柑橘果實采摘后用干凈的抹布擦去灰塵等，果實皮肉分離切成小塊，用液氮速凍后磨粉，各樣品混勻后放于-80 ℃冰箱儲存待用。

1.2.2

乙醇提取物的提取與類黃酮成分分析。快速稱取打成粉的果皮/果肉2 g于10 mL離心管中，加入7 mL乙醇，混勻后超聲波提取30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清，殘渣再加7 mL甲醇重復(fù)提取2次，合并上清液并定容至25 mL，放于4 ℃冰箱中備用。測定樣品時，取0.4 mL提取液，加入0.6 mL超純水稀釋后過0.2 μm親水性PTFE膜到2 mL 進(jìn)樣小瓶，待測。利用Q-Tof儀器分析提取液類黃酮成分的具體方法和儀器指標(biāo)參考Yang等[11]的研究。

同樣的提取方法，根據(jù)用量擴(kuò)大倍數(shù)，該試驗所用的果皮粉為50 g，果肉粉為100 g。得到的提取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉乙醇，將獲得的物質(zhì)分別溶解于10 mL和5 mL DMSO中得到高濃度提取液，將其用DMSO稀釋10倍得到中濃度提取液，再取部分中濃度提取液用DMSO稀釋10倍得到低濃度提取液。

1.2.3

體外抗氧化評價。

1.2.3.1

DPPH。參考Barreca等[12]的方法。準(zhǔn)確吸取500 μL 樣品于3.5 mL 75 μmol/L 的DPPH溶液中，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm 處測吸光度。以溶于80%乙醇的Trolox 溶液為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗氧化能力用Trolox 當(dāng)量TE表示。

1.2.3.2

ABTS。分別吸取0.1 mL 提取液，加4.9 mL ABTS反應(yīng)10 min 后，以純甲醇為對照，于734 nm 處測定吸光度。以溶于80%甲醇的Trolox 溶液為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線，Trolox 濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗氧化能力用Trolox 當(dāng)量TE表示。具體方法參見文獻(xiàn)[13]。

1.2.3.3

FRAP。準(zhǔn)確吸取200 μL提取液加到3.8 mL TPTZ 溶液中，反應(yīng)30 min 后，以0號（200 μL 80%甲醇+3.8 mL TPTZ）為對照，在593 nm 波長下檢測吸光度。以溶于80%甲醇的Trolox 溶液為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗氧化能力用Trolox 當(dāng)量TE表示。具體方法參見文獻(xiàn)[14]。

1.2.4

酵母胞內(nèi)活性氧ROS測定。為了定量有/無柑橘提取物生長時的酵母胞內(nèi)活性氧水平，具體試驗步驟參考文獻(xiàn)[15]。在30 ℃下，將溶于DMSO溶液的2 μL 5 mmol/L的ROS探針H2DCFDA加入1 mL在30 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 d 的酵母菌培養(yǎng)基中，混勻后反應(yīng)1 h。然后將培養(yǎng)基在無菌蒸餾水中洗滌2次并懸浮于1.0 mL 50 mmol/L Tris/Cl緩沖液（pH 7.5）中。加入20 μL氯仿和10 μL 0.1%（W/V）十二烷基硫酸鈉（SDS），并將細(xì)胞在30 ℃、200 r/min 條件下溫育30 min以使染料擴(kuò)散。 將培養(yǎng)物以5 000 r/min離心 5 min，使用酶標(biāo)儀在480 nm激發(fā)波長和520 nm發(fā)射波長下測量上清液的熒光。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

用Excel、GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行制圖、數(shù)據(jù)處理與差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4類柑橘果皮果肉乙醇提取物中10種類黃酮的分布情況

2.1.1 方法驗證。表2顯示，依照“1.2.2”方法，10種類黃酮單體在Qtof高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜儀中所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)都具有較好的線性關(guān)系。

2.1.2

提取物中類黃酮種類及含量分析。圖1為4種柑橘果皮果肉乙醇提取物中10種類黃酮成分的分布圖。由圖1可知，這8個樣品的類黃酮種類和含量都存在一定的差異。

從定量出的類黃酮種類上看，紅橘果皮最多，有6種，按含量由高到低分別為川陳皮素、橙皮苷、橘皮素、甜橙黃酮、異橙黃酮和蕓香柚皮苷；其次為奉節(jié)臍橙的果皮，含有5種；萬州大紅袍紅橘和奉節(jié)臍橙果肉所定量出的類黃酮種類最少，只有2種，為橙皮苷和蕓香柚皮苷。從含量上看，梁平柚和奉節(jié)臍橙果肉提取物的類黃酮總量較高，接近3.00 μg/g（FW）；其次 為奉節(jié)臍橙果肉、潼南尤力克檸檬和萬州大紅袍紅橘的果皮提取物，超過2.00 μg/g（FW）；最后為潼南尤力克檸檬、梁平柚和萬州大紅袍紅橘的果肉提取物，約為1.00 μg/g（FW）。另外，橙皮苷在檸檬、臍橙和紅橘中都有較大含量，柚皮苷在梁平柚中有大量分布，圣草次苷主要分布于檸檬中，蕓香柚皮苷主要分布于奉節(jié)臍橙中，山柰酚主要分布于梁平柚果皮中，地奧司明主要分布于檸檬和柚子的果肉中，而川陳皮素主要分布于臍橙和紅橘皮中。

2.2 4類柑橘果皮果肉乙醇提取物的抗氧化活性

DPPH、ABTS和FRAP法的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表3。4種柑橘成熟果實果皮果肉乙醇提取物的DPPH、ABTS和FRAP抗氧化能力如表4所示，數(shù)值均轉(zhuǎn)化為相應(yīng)柑橘材料的鮮重。由DPPH自由基清除試驗可知，4種柑橘果實果皮果肉乙醇提取物DPPH值為0.43～1.12 mg （TE）/g（FW）；其中奉節(jié)臍橙果皮的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，其次為奉節(jié)臍橙果肉，最弱的為梁平柚果皮。

由ABTS自由基清除試驗可知，4種柑橘果實果皮果肉乙醇提取物ABTS值為0.86～4.29 mg （TE）/g（FW）；其中奉節(jié)臍橙果皮的ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，其次為潼南尤力克檸檬果皮，最弱的為檸檬果肉。

由FRAP鐵離子還原試驗可知，4種柑橘果實果皮果肉乙醇提取物FRAP為0.77～1.93 mg （TE）/g（FW）。其中潼南尤力克檸檬果皮的FRAP自由基清除能力最強(qiáng)，其次為奉節(jié)臍橙果皮，最弱的為萬州大紅袍紅橘果肉。

由于運用DPPH、ABTS和FRAP 3種方法檢測出的4種柑橘果實果皮果肉乙醇提取物的抗氧化能力高低次序不一致，所以該試驗利用Seeram等[16]報道的一種綜合抗氧化能力評價指數(shù)方法來綜合評價所分析的4種柑橘果實果皮果肉乙醇提取物的抗氧化能力，并對它們抗氧化能力進(jìn)行排序（表4）。結(jié)果表明，不同品種柑橘果皮果肉的綜合抗氧化指數(shù)為41.60～96.38。奉節(jié)臍橙果皮的綜合抗氧化指數(shù)最高，其次為潼南尤力克檸檬果皮，潼南尤力克檸檬果肉乙醇提取物的綜合抗氧化指數(shù)最低。

2.3 4類柑橘果皮果肉乙醇提取物對酵母胞內(nèi)活性氧含量的影響

2.3.1

處理酵母菌的4類柑橘果皮果肉乙醇提取液的工作濃度。將按照“1.2.2”方法所得到的提取物溶解在相應(yīng)體積DMSO中的溶液定義為高濃度提取液，將高濃度提取液用DMSO稀釋10倍得到中濃度提取液，再取部分中濃度提取液稀釋10倍得到低濃度提取液。將高、中、低濃度分別換算為果實相應(yīng)部位的鮮重。具體數(shù)據(jù)見表5。

2.3.2

柑橘果實提取物對酵母胞內(nèi)活性氧含量的影響。由圖2可知，在該試驗所設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，柑橘果實提取物對酵母胞內(nèi)活性氧含量的影響呈現(xiàn)濃度依耐性，其對胞內(nèi)活性氧的抑制情況隨著濃度的增加而增加。由表6可知，奉節(jié)臍橙果皮的乙醇提取物的高濃度組具有最高的抑制能力，在其處理下的熒光強(qiáng)度減少了7.60；其次為紅橘果肉的乙醇提取物的高濃度組，熒光強(qiáng)度減少了7.31；潼南尤力克檸檬果皮的乙醇提取物的低濃度組具有最低的抑制能力，在其處理下的熒光強(qiáng)度僅僅減少了1.15。

3 結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明不同柑橘、同種柑橘不同部位的類黃酮種類和含量都存在差異，該結(jié)論與李秀娟[17]的結(jié)論一致?？傮w而言，柑橘果皮類黃酮物質(zhì)的種類與總含量高于果肉，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致[18-21]。其中，梁平柚果實中含量最高的是柚皮苷，奉節(jié)臍橙、萬州大紅袍紅橘和潼南尤力克檸檬果實提取物中含量較高的是橙皮苷，這與Arriaga等[22]的研究結(jié)論一致。此外，圣草次苷大量存在于潼南尤力克檸檬果實中，這與Miyake等[23]和 Kawaii等[24]的研究結(jié)論一致；川陳皮素大量存在于萬州大紅袍紅橘中，這與Whitman等[25]的研究結(jié)論一致；蕓香柚皮苷大量存在于奉節(jié)臍橙中，這與Albach等[26]的研究結(jié)論一致。

類黃酮具有較好的清除自由基和抗氧化作用[7]。分析表4和圖2可知，4種柑橘果皮果肉提取物的內(nèi)外抗氧化強(qiáng)度存在一定的差異，但總體而言，果皮提取物的內(nèi)外抗氧化能力高于果肉提取物。該結(jié)果可由“柑橘果皮類黃酮物質(zhì)的種類與總含量高于果肉”[18-21]來解釋。

通過比較分析該試驗的各部分結(jié)果，初步評估顯示，奉節(jié)臍橙具有較好的營養(yǎng)價值。果肉部分為食用部分，與其他3種柑橘果肉相比，奉節(jié)臍橙果肉含有最高的類黃酮含量、綜合抗氧化活性以及較高的活性氧清除能力。

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