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        雨生紅球藻培養(yǎng)基篩選及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

        2018-05-14 08:59:52柳科歡白歡馬力蘭利瓊卿人韋
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年27期

        柳科歡 白歡 馬力 蘭利瓊 卿人韋

        摘要 [目的]篩選出利于實(shí)驗(yàn)室來(lái)源的雨生紅球藻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基,優(yōu)化雨生紅球藻內(nèi)蝦青素的積累條件。[方法]選用7種培養(yǎng)基對(duì)4株雨生紅球藻分別進(jìn)行培養(yǎng),篩選出最適于4種藻株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。探究雨生紅球藻在光脅迫、高鹽、缺氮3種條件下誘導(dǎo)蝦青素積累情況。[結(jié)果]4個(gè)不同雨生紅球藻藻株在配方A培養(yǎng)基中的生物量比其他6種試驗(yàn)培養(yǎng)基的生物量高1.65~7.30倍;在優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基配方A中,HP3的生物量最大,可達(dá)7.13×106 個(gè)/mL;HP3在缺氮的脅迫條件下,蝦青素產(chǎn)量最高,可達(dá)21.05 mg/L,比光誘導(dǎo)獲得的最佳蝦青素產(chǎn)量高1.07倍,比高鹽獲得的最佳蝦青素產(chǎn)量高1.64倍。[結(jié)論]該研究中最適于試驗(yàn)藻株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是配方A,當(dāng)脅迫條件為缺氮10%時(shí)蝦青素積累量最大。

        關(guān)鍵詞 雨生紅球藻;蝦青素;培養(yǎng)基篩選;脅迫條件

        中圖分類(lèi)號(hào) S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2018)27-0013-04

        Medium Optimization and Inducing Conditions Optimization of Haematococcus pluvialis

        LIU Kehuan1 ,BAI Huan2,MA Li1 et al

        (1.College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu,Sichuan 610064;2. Electric Power Research Institute of Sichuan Electric Power Company, Chengdu,Sichuan 610072)

        Abstract [Objective] Medium for culturing Haematococcus pluvialis originated from laboratory was screened, accumulation conditions of astaxanthin in Haematococcus pluvialis were optimizated .[Method] Seven culture mediums were used to cultivate four kinds of Haematococcus pluvialis, 4 kinds of mediums were obtained. Astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis were exposed under lightinduced, highsalt, and nitrogendeficient respectively. [Result]Biomass about four strains algae in the formula A medium was 165-7.30 times of that in the other six mediums, HP3 gained the largest biomass in formula A, the maximum biomass was up to 7.13×106 cell/mL. Under nitrogen deficiency condition, the astaxanthin production was up to 21.05 mg/L, this number was 1.07 times of the best astaxanthin yield obtained by light, and 1.64 times of the maximum astaxanthin yield obtained by high salt. [Conclusion] The most suitable Haematococcus pluvialis medium was formula A and the regnant astaxanthin accumulation condition was 10% in this study.

        Key words Haematococcus pluvialis;Astaxanthin;Medium optimization;Stress conditions

        基金項(xiàng)目 四川省科技廳項(xiàng)目(2014JY0171);四川省電科院項(xiàng)目(13H1138)。

        作者簡(jiǎn)介 柳科歡(1994—),女,貴州興義人,碩士研究生,研究方向:藻類(lèi)分類(lèi)及資源利用。

        *通訊作者,副教授,博士,從事藻類(lèi)學(xué)及能源微藻油脂代謝領(lǐng)域研究。

        收稿日期 2018-07-17

        蝦青素(3,3-二羥基-β,β-胡蘿卜素-4,4-二酮)是一種次生類(lèi)胡蘿卜素,具有一個(gè)多烯鏈,鏈兩端各接一個(gè)β環(huán),每個(gè)β環(huán)上又各含有一個(gè)羥基和一個(gè)酮基,13個(gè)共軛雙鍵與單鍵交替存在于蝦青素結(jié)構(gòu)中,這賦予了蝦青素強(qiáng)抗氧化能力,可中和細(xì)胞內(nèi)自由基和清除細(xì)胞內(nèi)活性氧[1-3],蝦青素的這種特性使得其被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、水產(chǎn)、農(nóng)業(yè)、化妝品等多個(gè)行業(yè)。目前,市場(chǎng)上的蝦青素95%以上是化學(xué)合成,只有不到1%是藻類(lèi)來(lái)源[4-6]。合成蝦青素存在食品安全、環(huán)境污染和產(chǎn)品活性低等問(wèn)題[5,7-8],所以相對(duì)于合成蝦青素而言,天然蝦青素有更好地發(fā)展前景。雨生紅球藻被公認(rèn)為自然界中最具商業(yè)價(jià)值的天然蝦青素來(lái)源。雨生紅球藻中蝦青素的生物合成和積累需在脅迫條件下進(jìn)行,然而脅迫條件并不利于藻株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),所以現(xiàn)在通過(guò)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素在工業(yè)上是通過(guò)2個(gè)步驟來(lái)進(jìn)行,即先進(jìn)行雨生紅球藻綠色營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)積累藻類(lèi)生物量,然后進(jìn)行雨生紅球藻脅迫積累蝦青素。

        雨生紅球藻綠色營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的生物量決定蝦青素的總產(chǎn)量,所以雨生紅球藻培養(yǎng)條件的探索,依然是利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素這一領(lǐng)域的重要課題。一些報(bào)道顯示,普通的微藻無(wú)機(jī)培養(yǎng)基不利于雨生紅球藻生物量的大量積累,雨生紅球藻綠色營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的高產(chǎn)需要在有機(jī)培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)[9]。雨生紅球藻對(duì)培養(yǎng)基中的pH變化比較敏感,培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基成分不斷消耗,藻細(xì)胞代謝物持續(xù)產(chǎn)生,培養(yǎng)基中的pH發(fā)生變化,進(jìn)而限制藻的生物量。目前已有研究證明,在藻種培養(yǎng)過(guò)程中向培養(yǎng)液中通入1%~2%的CO2(CO2/air),可有效解決由pH變化和營(yíng)養(yǎng)物消耗引起的藻細(xì)胞生長(zhǎng)受限的問(wèn)題[10],實(shí)際操作中基于通氣過(guò)程中氣體流失的考慮,通氣量需高于理論值。

        雨生紅球藻在脅迫過(guò)程中,尤其是脅迫前期,藻中積累的蝦青素含量很低,不易直接測(cè)定。雨生紅球藻在脅迫條件下,其細(xì)胞內(nèi)初級(jí)類(lèi)胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為次生類(lèi)胡蘿卜素(主要是蝦青素,其占總類(lèi)胡蘿卜素的80%~99%),總類(lèi)胡蘿卜素含量明顯增加[11-12],所以可通過(guò)測(cè)定雨生紅球藻中總類(lèi)胡蘿卜素變化量來(lái)側(cè)面反應(yīng)蝦青素積累情況。

        為了篩選出最適于試驗(yàn)藻株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基,以提高藻中蝦青素的產(chǎn)量,該研究選用7種雨生紅球藻培養(yǎng)基(BBM、OHM、改良MCM、配方A、BG11、BG11-1、BG11-21),對(duì)HP1、HP2、HP3、HP4 4株雨生紅球藻藻株進(jìn)行比較培養(yǎng)。再利用篩選出的優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基和在優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)最好的藻株,研究不同光照強(qiáng)度、高鹽、缺氮脅迫條件下蝦青素的積累情況。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)藻種和基本培養(yǎng)條件

        試驗(yàn)藻種雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)HP1、HP2、HP3、HP4,是通過(guò)分離純化、長(zhǎng)期保存的藻株。

        1.2 培養(yǎng)基篩選時(shí)期的培養(yǎng)條件

        雨生紅球藻培養(yǎng)條件:初始接種量為2.00×104 個(gè)/mL,培養(yǎng)溫度為(24±1)℃,光照強(qiáng)度為1 500~1 800 lx,光照周期是12 h/12 h(光/暗),通氣條件為4%(CO2/air,v/v),在500 mL三角瓶中盛裝400 mL培養(yǎng)基。每個(gè)試驗(yàn)做3瓶平行對(duì)照,每瓶每次取2個(gè)樣測(cè)定參數(shù)。

        1.3 蝦青素脅迫時(shí)期的培養(yǎng)條件和脅迫條件的設(shè)定

        利用配方A培養(yǎng)基培養(yǎng)HP3藻株,基本培養(yǎng)條件為:溫度(24±1)℃,光照強(qiáng)度1 500~1 800 lx,光照周期12 h/12 h(光/暗),通氣量4%(CO2/air,v/v),培養(yǎng)規(guī)模是1 000 mL三角瓶培養(yǎng)700 mL藻液。HP3在配方A中培養(yǎng)15 d后,藻液經(jīng)4 000 r/min離心10 min后收集藻細(xì)胞,用少量配方A培養(yǎng)基重懸藻細(xì)胞,將懸浮液均分轉(zhuǎn)至各脅迫條件下培養(yǎng),脅迫培養(yǎng)的接種濃度為5×105~6×105 個(gè)/mL,脅迫培養(yǎng)時(shí)除脅迫變量外,其他培養(yǎng)條件不變。

        選取3個(gè)因素(光照強(qiáng)度、高鹽和缺氮)進(jìn)行脅迫研究。光脅迫研究中,光源為opple三基色(紅綠藍(lán))、24 W,設(shè)置8 000、10 000、12 000 lx 3個(gè)光照強(qiáng)度的梯度;高鹽脅迫研究是在10 000 lx光照強(qiáng)度基礎(chǔ)上,向配方A培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaAc,設(shè)置20、30、40、50 mmol/L NaAc 4個(gè)濃度梯度;缺氮脅迫研究,是在10 000 lx光照強(qiáng)度基礎(chǔ)上,將配方A培養(yǎng)基中NaNO3(含氮4 mmol/L)的含量調(diào)整為原培養(yǎng)基的5%、10%、15%、20%。

        每個(gè)脅迫條件做3瓶平行對(duì)照,每天取一次樣進(jìn)行色素含量檢測(cè),每瓶每次測(cè)2個(gè)樣。

        46卷27期 柳科歡等 雨生紅球藻培養(yǎng)基篩選及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

        1.4 色素提取與測(cè)定

        取5 mL藻液,經(jīng)4 000 r/min離心15 min,棄上清,再加入1 mL DMSO,混合均勻后65 ℃水浴5 min,待樣品冷卻至室溫后,7 000 r/min離心2~3 min收集上清液,所得的沉淀用DMSO反復(fù)提取至基本無(wú)色,合并收集所得的上清液并定容到5 mL待測(cè)。

        紫外分光光度計(jì)檢測(cè)色素含量,用DMSO稀釋待測(cè)提取液使其分光光度計(jì)讀數(shù)在0.2~1.5范圍,DMSO作為空白對(duì)照,分別在波長(zhǎng)666、649、480 nm處讀取數(shù)據(jù),計(jì)算公式如下:

        Cchla(mg/L)=(13.34×A666-4.85×A649)×稀釋倍數(shù)(1)

        Cchlb(mg/L)=(24.58×A649-6.65×A666)×稀釋倍數(shù)(2)

        Ccar(mg/L)=(1 000×A480-1.29×Cchla-4.85×Cchlb)/220×稀釋倍數(shù)(3)

        式中,A666、A649、A480分別為待測(cè)樣品在波長(zhǎng)480、649、666 nm處吸光值;

        Cchla、Cchlb、Ccar分別為葉綠色a、葉綠色b、總類(lèi)胡蘿卜素含量。

        1.5 蝦青素測(cè)定方法

        準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25 g NaOH加入雙蒸水4.75 mL,得5%氫氧化鈉溶液,待用。取藻液5 mL,經(jīng)3 900 r/min離心15 min,收集沉淀,向沉淀中加入700 μL 5%氫氧化鈉溶液和300 μL甲醇溶液,混勻,65 ℃水浴加熱15 min除去樣品中的葉綠素,待加熱后的樣品冷卻至室溫后,7 000 r/min離心2~3 min收集沉淀,用雙蒸水洗滌沉淀3次,再向沉淀中加入1 mL DMSO,65 ℃水浴加熱5 min,待樣品冷卻至室溫,7 000 r/min離心2~3 min收集上清液,沉淀用DMSO重復(fù)提取至基本無(wú)色,合并收集的上清液并定容于5 mL。

        用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取樣品,DMSO為空白對(duì)照,檢測(cè)波長(zhǎng)是490 nm,蝦青素含量由以下公式計(jì)算:

        Cast(mg/L)=(4.5×A490×V1)/V2×稀釋倍數(shù)(4)

        式中,A490為待測(cè)樣品在波長(zhǎng)490 nm處吸光值;

        Cast為蝦青素含量;

        V1、V2分別為提取所得液體體積、提取所用藻液體積(mL)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 培養(yǎng)基篩選

        4株試驗(yàn)藻種在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如圖1所示。同一藻種在7種試驗(yàn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)23 d后,各組藻生物量出現(xiàn)明顯差異。HP1在配方A培養(yǎng)基中生物量最大,可達(dá)6.44×106個(gè)/mL,在改良MCM培養(yǎng)基中生物量最低,為1.73×106 個(gè)/mL;HP2在配方A中的生物量(5.07×106 個(gè)/mL)最大,在OHM中的生物量(2.67×106 個(gè)/mL)次之;HP3在配方A中生物量最大,為7.13×106 個(gè)/mL,是HP3在改良MCM中的7.29倍;HP4在7種試驗(yàn)培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)23 d后,各種培養(yǎng)基及其對(duì)應(yīng)的生物量情況如下:配方A(5.16×106 個(gè)/mL)、OHM(2.94×106 個(gè)/mL)、BG11-1(2.91×106 個(gè)/mL)、BG11(2.60×106 個(gè)/mL)、BBM(2.53×106 個(gè)/mL)、BG11-2.1(1.88×106 個(gè)/mL)、改良MCM(1.33×106 個(gè)/mL)。

        上述結(jié)果表明,HP1、HP2、HP3、HP4 4株試驗(yàn)藻株篩選的優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基的結(jié)果一致,都顯示藻株在配方A中的生物量最高。

        2.2 蝦青素誘導(dǎo)

        如圖2所示為HP3在不同脅迫條件下總類(lèi)胡蘿卜素變化。在3種脅迫條件下處理9 d,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),藻液中總類(lèi)胡蘿卜素呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。光誘導(dǎo)9 d后,光照強(qiáng)度為10 000 lx條件下藻液中類(lèi)胡蘿卜素含量最高,為12.10 mg/L;10 000 lx條件下,高鹽脅迫9 d后,30 mmol/L NaAc條件下藻液中類(lèi)胡蘿卜素含量最高,達(dá)8.91 mg/L,50 mmol/L NaAc條件下藻液中類(lèi)胡蘿卜素含量最低,為5.87 mg/L;在10 000 lx條件下,缺氮脅迫9 d后,各梯度下總類(lèi)胡蘿卜素含量情況是10%(22.46 mg/L)、5%(21.35 mg/L)、15%(18.62 mg/L)、20%(14.24 mg/L)。

        結(jié)果表明,缺氮脅迫下藻液中總類(lèi)胡蘿卜素含量,比光誘導(dǎo)和高鹽2種脅迫條件下大。

        如圖3所示為HP3在不同脅迫條件處理9 d后蝦青素積累情況。HP3在光脅迫9 d后,光照強(qiáng)度為10 000 lx時(shí)蝦青素含量最高,可達(dá)10.17 mg/L;光照強(qiáng)度10 000 lx時(shí),HP3在高鹽脅迫9 d后,30 mmol/L NaAc條件下蝦青素含量最高,為7.97 mg/L,50 mmol/L NaAc條件下蝦青素含量最低,為3.16 mg/L;缺氮脅迫9 d后,各梯度下蝦青素含量情況是:10%(21.05 mg/L)、5%(19.93 mg/L)、15%(16.71 mg/L)、20%(12.86 mg/L)。

        上述結(jié)果表明,10 000 lx條件下,缺氮脅迫下藻液中蝦青素含量以及脅迫前后藻液,比光誘導(dǎo)和高鹽2種脅迫條件下都大,并且該結(jié)果與不同脅迫條件下總類(lèi)胡蘿卜素含量結(jié)果一致。

        3 討論

        Choi等[13]利用OHM培養(yǎng)雨生紅球藻獲得最大藻細(xì)胞濃度為2.1×105 個(gè)/mL,吳曉娟等[14]研究數(shù)據(jù)顯示,BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)雨生紅球藻可獲得藻細(xì)胞濃度為2×105 個(gè)/mL,王正方等[15]對(duì)雨生紅球藻培養(yǎng)基BG11進(jìn)行優(yōu)化研究,獲得最大藻細(xì)胞濃度為1.7×105 個(gè)/mL,試驗(yàn)的培養(yǎng)條件下4種雨生紅球藻藻株在OHM、BG11、BG11改良培養(yǎng)基取得最佳生物量分別是3.88×106 個(gè)/mL(HP3)、3.21×106 個(gè)/mL(HP4)、3.67×106 個(gè)/mL(HP3在BG11-1中培養(yǎng)取得)。對(duì)比上述對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的生物量可知,該研究培養(yǎng)條件下獲得的生物量約為上述列舉數(shù)據(jù)的10倍,可能原因是在實(shí)驗(yàn)室適當(dāng)?shù)耐馀囵B(yǎng),更加有利于雨生紅球藻綠色營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)。該研究在雨生紅球藻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中,向培養(yǎng)液中通入4%的CO2(CO2/Air,v/v),有效調(diào)整培養(yǎng)基pH的同時(shí),還對(duì)培養(yǎng)基補(bǔ)充碳源,試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)通氣條件能夠在短期內(nèi)將雨生紅球藻紅色孢子轉(zhuǎn)化為綠色營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。4株系雨生紅球藻在7種試驗(yàn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)23 d后,在配方A、OHM、BG11-1 3種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況比較好,并在配方A中取得生物量最佳,4株系雨生紅球藻在配方A中的生物量約是OHM和BG11-1中的2倍。

        在光合生物中,光照強(qiáng)度的改變可以激發(fā)雨生紅球藻細(xì)胞積累蝦青素,保護(hù)自身免受光氧化損傷[16-17],但是不同微藻積累蝦青素最適光照強(qiáng)度和光照脅迫時(shí)間存在差異[18-19],例如,該研究中HP3在光照強(qiáng)度10 000 lx下脅迫9 d后,蝦青素積累最高可達(dá)10.17 mg/L,陶云瑩等[20]研究雨生紅球藻在70 000 lx光照強(qiáng)度下脅迫10 d可獲得蝦青素量4.54 mg/L,才金玲等[21]研究雨生紅球藻在14 800 lx光照強(qiáng)度下脅迫15 d可獲得蝦青素量2.88 mg/L。鹽濃度對(duì)雨生紅球藻內(nèi)蝦青素形成的影響較復(fù)雜,微藻種類(lèi)以及生長(zhǎng)環(huán)境不同,對(duì)于鹽的耐受程度存在差異。高濃度乙酸鈉脅迫時(shí),乙酸根可降低藻細(xì)胞防御蛋白酶的活性,使得細(xì)胞更加依賴(lài)于蝦青素的抗氧化功能[22],從而促進(jìn)藻細(xì)胞蝦青素積累,但是高鹽脅迫會(huì)影響藻細(xì)胞的滲透作用[23],減少藻生物量。氮源濃度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)對(duì)微藻產(chǎn)生脅迫作用,但一般而言,微藻(尤其是雨生紅球藻)中缺氮對(duì)蝦青素積累量的影響要大于高濃度的氮對(duì)蝦青素積累量的影響[24]。雨生紅球藻培養(yǎng)物中氮的缺乏會(huì)抑制1,5一二磷酸核酮糖羧化酶的合成,從而影響卡爾文循環(huán)的第1個(gè)固碳反應(yīng),從而對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行脅迫[25]。缺氮脅迫雨生紅球藻積累蝦青素時(shí),氮的缺失是有限度的,缺氮到一定程度會(huì)嚴(yán)重降低藻種的生物量,并降低總的色素產(chǎn)量[16,26-27]。該研究中,光脅迫下蝦青素的積累量明顯低于缺氮,這是由于前者是單因素誘導(dǎo),后者是雙因素誘導(dǎo),光和缺氮2個(gè)因子是通過(guò)不同途徑對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行脅迫的,其作用效果是疊加的[24]。光照強(qiáng)度10 000 lx條件下,脅迫下蝦青素積累量較低,可能原因是鹽濃度過(guò)高。

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