劉鰩　胡雪麗　鐘秋梅等

摘要：為提高路鄧葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）單寧酶（Sl-tan）的活性，該文利用化學(xué)合成方法獲得Sl-tan基因，將該基因連接到重組表達(dá)質(zhì)粒pET43.1-A，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21-DE3中進(jìn)行表達(dá)，通過親和層析柱純化，以沒食子酸甲酯為底物進(jìn)行酶活性測(cè)定以及酶學(xué)性質(zhì)分析，并基于生物信息學(xué)分析，結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)Sl-tan進(jìn)行人工改造。結(jié)果顯示，獲得的重組單寧酶產(chǎn)量明顯增高，最高可達(dá)42 mg/L發(fā)酵液；酶學(xué)性質(zhì)研究顯示該酶在pH 8.0，溫度40℃時(shí)獲得的活性最高（40 U/mg）；Ala460突變?yōu)镻r0460后的Sl-tan活性可提高82.5%。

關(guān)鍵詞：路鄧葡萄球菌；單寧酶；三明治結(jié)構(gòu)；定點(diǎn)突變；沒食子酸甲酯

中圖分類號(hào)：TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2018）09-0063-06

0引言

單寧是一種水溶性多酚化合物，在植物界中廣泛存在。單寧中含有豐富的碳源，但由于其含有大量的芳香環(huán)類結(jié)構(gòu)，易于螯合金屬離子，并與蛋白聚合形成不可溶性沉淀，導(dǎo)致單寧難以被降解利用。一些微生物能夠表達(dá)單寧酶，將單寧水解為五倍子酸與葡萄糖，為微生物生長(zhǎng)提供碳源以及能源物質(zhì)。單寧酶是已知的唯一能夠降解單寧的生物酶類，因此被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)、制藥行業(yè)以及動(dòng)物飼料的生產(chǎn)中。

目前，單寧酶的生產(chǎn)主要通過產(chǎn)單寧酶菌株的液態(tài)深層發(fā)酵以及固體發(fā)酵兩種方法，耗時(shí)長(zhǎng)、產(chǎn)量低、成本高、難以純化，且生產(chǎn)的單寧酶通常以粗酶或者菌體形式應(yīng)用，不利于單寧酶的應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，將單寧酶基因克隆，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，利用表達(dá)宿主進(jìn)行表達(dá)的方法也已經(jīng)取得初步成效。Iwamoto等，首次將乳酸桿菌單寧酶（Lp-tan）基因通過基因擴(kuò)增構(gòu)建Lp-tan重組表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌DH5α中成功表達(dá)，但是純化后酶的產(chǎn)量與活性較低。在此基礎(chǔ)上，Wu等通過LIC-PCR的方式構(gòu)建了Lp-tan的重組表達(dá)質(zhì)粒，并優(yōu)化表達(dá)用宿主細(xì)胞，最終在大腸桿菌BL21-DE3中實(shí)現(xiàn)了Lp-tan的高產(chǎn)量表達(dá)，并保持了較高的酶活性。目前為止，已經(jīng)從米曲霉（Aspergillus oryzae）、乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）以及鏈霉菌（Streptomyces sviceus）中克隆了單寧酶基因，通過異源重組表達(dá)的方法生產(chǎn)單寧酶，取得了較好的結(jié)果。

本文通過化學(xué)合成獲得了路鄧葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）的單寧酶基因Sl-tan，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，使其在大腸桿菌宿主中進(jìn)行表達(dá)，并通過與Lp-tan的氨基酸序列比對(duì)分析，結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的Lp-tan的結(jié)構(gòu)（PDB序列號(hào)：4JOC）、Lp-tan與底物沒食子酸乙酯的結(jié)構(gòu)（PDB序列號(hào)：4JOK）、Lp-tan與產(chǎn)物五倍子酸的結(jié)構(gòu)（PDB序列號(hào)：4JOH）對(duì)Sl-tan進(jìn)行定點(diǎn)改造。改造后獲得的重組Sl-tan活性較改造之前提高了82.5%。

1材料與儀器

1.1材料

大腸桿菌DH5a、BL21-DE3菌株以及質(zhì)粒pET-43.1-A均為實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI、T4 DNA連接酶購(gòu)買自Thermo-Fisher；DNA聚合酶購(gòu)買自TaKaRa；DNA膠回收試劑盒購(gòu)買自QIAGEN；定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)買自北京全式金；商品化米曲霉單寧酶（Wako，Japan）；沒食子酸甲酯、單寧酸、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)買自Sigma；咪唑購(gòu)買自科龍（成都）；10KD濃縮管購(gòu)買自Millipore。

1.2儀器

超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司SW-CZ-1F）；蛋白純化儀（蘇州利穗）；全自動(dòng)高壓蒸汽消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司YX280A）；搖床（上海智誠(chéng)）；10mLHisTrapHP親和層析柱（博格?。?；超聲破碎儀（寧波新芝）；高速冷凍離心機(jī)（貝克曼，美國(guó)）。

2方法

2.1目的基因獲取

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找Sl-tan基因（GenBank：KU882097.1），通過化學(xué)合成的方法獲得完整的基因序列（擎科生物，成都）。

2.2重組載體的構(gòu)建

本文中利用的重組表達(dá)載體為改造后的pET43.1-A（僅保留N端His-tag，并在His-tag后引人煙草花葉病毒酶（TEV）的酶切位點(diǎn)，去除了原先質(zhì)粒上的S-tag以及NusA-tag），以合成的Sl-tan基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物序列為CGGATCC-ATGAAA

GACTTTCATATC-ACTCT，下游引物序列為CCTCGAG-CTATTTTTT-ATTAATACTTTCTACC（斜體為BamHI和XhoI的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基），擴(kuò)增條件為95℃30 s，52℃30 s，72℃2min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物與pET43.1-A質(zhì)粒同時(shí)用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切后用膠回收試劑盒純化。將純化后的雙酶切質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物按照1：3的比例混合后，用T4 DNA連接酶在室溫下連接1h，轉(zhuǎn)化DH5a，涂含有卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜后，挑取單克隆提質(zhì)粒，并送公司（擎科生物，成都）測(cè)序。

2.3誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21-DE3，涂含有卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜后挑取單克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀值為0.6左右時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，6000 r/min離心30 min，棄上清，收集菌體。

將收集的菌體用平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/LNaCl，20 mmol/L咪唑，pH 8.0）重懸，超聲破碎15 min，離心后收集上清并過5μm孔徑濾膜，收集上清并用蛋白純化儀過10 mL HisTrapHP親和層析柱，用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl+100 mmol/L NaCl+300 mmol/L咪唑，pH8.0）梯度洗脫。

2.4 TEV酶切去除N末端組氨酸標(biāo)簽

載體pET43.1-A自身帶有18個(gè)氨基酸的組氨酸標(biāo)簽，在組氨酸標(biāo)簽后帶有煙草花葉病毒酶（TEV）的酶切位點(diǎn)。為了去除組氨酸標(biāo)簽對(duì)Sl-tan活性的影響，用TEV酶切去除組氨酸標(biāo)簽。將親和層析后的Sl-tan，用透析緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl+100 mmol/L NaCl，pH 8.0）透析，去除咪唑，然后與TEV按照100：1的比例混合，4℃條件酶切過夜。經(jīng)酶切后的Sl-tan（加入20mmol/L咪唑）再次過組氨酸親和層析柱純化，收集穿透峰樣品。

2.5酶活性的測(cè)定

酶活性單位U的定義：在溫度為40℃，pH為8.0的條件下，每分鐘內(nèi)水解底物生成1μmol產(chǎn)物五倍子酸所需要的酶量，定義為一個(gè)酶活性單位U。

單寧酶可以水解沒食子酸甲酯以及單寧酸，釋放出五倍子酸。通過繞單寧和五倍子酸的特異反應(yīng)，可以測(cè)定單寧酶的活性。以25 mmol/L沒食子酸甲酯作為底物，單寧酶可以水解沒食子酸甲酯（MG），生成五倍子酸，五倍子酸（GA）可以與繞單寧反應(yīng)，用NaOH終止反應(yīng)，測(cè)520 nm的吸光度，顯色強(qiáng)度與五倍子酸的量成正比。在700μL的反應(yīng)緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl+100 mmol/L NaCl，pH 8.0）中加入0.1μg的單寧酶與40μL摩爾濃度為25 mmol/L的沒食子酸甲酯在40℃條件下溫育5 min，然后加入150μL質(zhì)量濃度為0.667%的繞單寧溶液再次在40℃下溫育5mm，隨后加入100μL摩爾濃度為500 mmol/L的NaOH溶液反應(yīng)5 min終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)檢測(cè)酶解液在520 nm下的吸光度值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：以0.125～1 mmol/L的五倍子酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與繞單寧反應(yīng)，測(cè)520nm的吸光度，以五倍子酸的濃度為橫坐標(biāo)對(duì)縱坐標(biāo)吸光度值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6溫度與pH對(duì)酶活性的影響

為了研究酶的最適反應(yīng)溫度與pH，將純化的單寧酶在10～80℃條件下以沒食子酸甲酯為底物，在pH值為8.0的條件測(cè)定酶的活性，以測(cè)得的最高活性值為100%作圖。在溫度為37℃時(shí)，配制pH值為3.0～10.0的緩沖液，以沒食子酸甲酯為底物檢測(cè)酶的活性，以測(cè)得最高活性數(shù)值為100%作圖。

2.7單寧酶的序列分析及定點(diǎn)突變

乳酸桿菌單寧酶具有較高的生物活性，且其三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，并且根據(jù)其結(jié)構(gòu)闡明了單寧酶的水解機(jī)制。通過Expasy Align比對(duì)分析Lp-tan與Sl-tan單寧酶的差異，并結(jié)合已報(bào)到的乳酸桿菌單寧酶的結(jié)構(gòu)與水解機(jī)制，對(duì)差異位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，具體突變方法如下：

通過PCR的方法，以包含Sl-tan基因的質(zhì)粒為模板，按照定點(diǎn)突變?cè)噭┖性噭┖幸?，設(shè)計(jì)引物（上游引物：TTTAAA CGTAGCCAA-CAG-GAAA-ATGAAGT；下游引物：CTG-TTGGCTACGTTTTAA-ATCATC，斜體表示突變位點(diǎn)），進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94℃30 s，60℃30 s，72℃8 min，20個(gè)循環(huán)）。將獲得的PCR產(chǎn)物用DpnI酶處理，消化掉模板質(zhì)粒。將酶切后的PCR產(chǎn)物跑1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠后回收PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂平板后于37℃培養(yǎng)24 h后，挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，過夜培養(yǎng)。提質(zhì)粒，送測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-DE3感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)、純化及活性測(cè)定，方法同前。

3結(jié)果

3.1目的基因PCR擴(kuò)增及酶切鑒定結(jié)果

以合成的Sl-tan基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR，1.0%瓊脂糖凝膠電泳可見1800 bp左右的DNA片段，與預(yù)期一致（見圖1）。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登陸序列一致。

3.2蛋白表達(dá)與純化

用大腸桿菌BL21-DE3作為宿主表達(dá)蛋白并于20℃過夜誘導(dǎo)。收菌后，超聲破碎，將上清用蛋白純化儀進(jìn)行純化。表達(dá)載體pET43.1-A，帶有N末端組氨酸標(biāo)簽，表達(dá)的目的蛋白前端含有MG-HHHHHHGTENLYFQGS氨基酸序列。破碎后上清過組氨酸親和層析柱，用高濃度咪唑梯度洗脫，在咪唑濃度為80～170 mmol/L之間出峰。酶切去除N末端組氨酸標(biāo)簽后，再次用鎳柱親和純化后得到純度95%以上的單寧酶。10%SDS-PAGE電泳驗(yàn)證（見圖2），在分子量67 kD左右有明顯的單一目的條帶，與Sl-tan中單寧酶分子量大小相符，純化后，重組單寧酶的產(chǎn)量為42 mg/L菌液。

3.3溫度和pH值對(duì)酶活性的影響

在不同pH值和不同溫度條件下，測(cè)定純化后單寧酶的活性，如圖3（a）所示，在pH7～9時(shí)，酶可以保持相對(duì)較高的活性，在pH值8附近，酶的活性最高；如圖3（b）所示，在溫度30～60℃時(shí)，酶可以保持相對(duì)較高的活性，在40℃附近，酶的活性最高。

將純化后的Sl-tan在40℃，pH 8.0的最適條件下，以沒食子酸甲酯為底物進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果顯示帶有N端組氨酸標(biāo)簽的單寧酶活性為40 U/mg，去除標(biāo)簽后的單寧酶活性并未有明顯變化。

3.4 Sl-tan的改造

Sl-tan與Lp-tan的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示兩者只有21.9%的序列同源性，但在Sl-tan中具有與Lp-tan相同的單寧酶酶活性中心保守序列G-X-S-X-G-G（X代表任意氨基酸，見圖4）。在Lp-tan中Pr0356-底物-Ile206形成類似于三明治的結(jié)構(gòu)，Pro356的苯環(huán)結(jié)構(gòu)能夠穩(wěn)定底物結(jié)合，但是在Sl-tan中，用于形成三明治結(jié)構(gòu)的Pro被Ala取代，從而破壞了三明治結(jié)構(gòu)。通過定點(diǎn)突變的方法在Sl-tan中重建三明治結(jié)構(gòu)（Ala460突變?yōu)镻r0460），活性測(cè)定結(jié)果顯示重建三明治結(jié)構(gòu)后的Sl-tan活陛為73 U/mg，與野生Sl-tan相比，酶活性提高82.5%（見表1）。

4討論

現(xiàn)階段，我國(guó)單寧酶的研究主要集中在產(chǎn)單寧酶的菌株篩選上，對(duì)產(chǎn)單寧酶的菌株進(jìn)行誘變以獲取高產(chǎn)菌株。另外，對(duì)單寧酶的應(yīng)用也主要是以粗酶形式，或者直接以發(fā)酵后的菌體作為單寧酶使用，由于粗酶或者菌體直接作用可能存在細(xì)菌污染，限制了單寧酶的應(yīng)用。

前期研究中，本課題組通過基因重組表達(dá)的方式將乳酸桿菌中的單寧酶基因以及鏈霉菌中的單寧酶的基因進(jìn)行克隆，并用大腸桿菌BL21-DE3進(jìn)行表達(dá)，最終獲得高產(chǎn)量的單寧酶，并且保持了較高的酶活性。與傳統(tǒng)的單寧酶生產(chǎn)方式相比，更易于獲得高純度的單一的單寧酶，有利于單寧酶的工業(yè)化應(yīng)用，但是能夠用于重組表達(dá)的單寧酶仍然很少。

本文通過基因工程方法將Sl-tan基因進(jìn)行克隆，并在大腸桿菌BL21-DE3中進(jìn)行成功表達(dá)，獲得了高產(chǎn)量的Sl-tan（42 mg/L菌液）。對(duì)Sl-tan的活性研究顯示，其在pH 8.0，溫度40℃的條件下具有最高活性，但進(jìn)一步的活性測(cè)定結(jié)果顯示其活性較低（40 U/mg）。在之前的研究中，我們報(bào)道了Lp-tan的晶體結(jié)構(gòu)，并對(duì)單寧酶的水解機(jī)制進(jìn)行了解析。通過對(duì)Sl-tan與Lp-tan的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩種單寧酶的序列相似度只有21.9%，但是兩種單寧酶具有相同的活性中心序列，進(jìn)一步比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在Lp-tan中形成的有利于底物結(jié)合的Pro356-底物-Ile206三明治的結(jié)構(gòu)，在Sl-tan中被Ala460-底物-Ile271所替代（見圖4）。因此，本文利用定點(diǎn)突變技術(shù)在Sl-tan中將Ala460突變?yōu)镻ro460，重建三明治結(jié)構(gòu)，活性測(cè)定結(jié)果顯示突變后的Sl-tan活性提高了82.5%，研究結(jié)果也進(jìn)一步說明了在單寧酶中形成的三明治結(jié)構(gòu)有利于底物沒食子酸甲酯的結(jié)合。

5結(jié)束語

本研究通過化學(xué)合成的方法獲得了Sl-tan的基因，并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒使其在大腸桿菌中表達(dá)，獲得了高產(chǎn)量、高純度的Sl-tan。對(duì)Sl-tan定點(diǎn)突變（Ala460突變?yōu)镻ro460）重建三明治結(jié)構(gòu)后，使Sl-tan的活性提高了82.5%，使其能夠更好地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)際。