沙云菲 董惠忠 張耀 馬開玥 張薄博 許贛榮 陳磊

摘要：為降低上部煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)等大分子成分含量，提高其吸食品質(zhì)，本研究在統(tǒng)一評價(jià)酶活力的基礎(chǔ)上，選用4種酶制劑（淀粉酶IV.蛋白酶I、果膠酶I和纖維索酶II）配制復(fù)合酶制劑，采用單因素法和Box-Benhnken響應(yīng)面分析法對影響酶解效果的復(fù)合酶量、緩沖液pH、含水量和酶解時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化。分析顯示，4個(gè)因素對上部煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)降解率的影響順序?yàn)椋壕彌_液pH>酶解時(shí)間>含水量>復(fù)合酶量。響應(yīng)面分析結(jié)果確定最優(yōu)酶解條件為：復(fù)合酶量1.1單位（即淀粉酶Ⅳ33U/g煙葉，蛋白酶I 550U/g煙葉，果膠酶1220U/g煙葉，纖維索酶II220U/g煙葉）、緩沖液pH 7.7、含水量54%、酶解時(shí)間5.5 h，此時(shí)淀粉和蛋白質(zhì)降解率分別為19.54%和20.03%。本研究中的復(fù)合酶制劑及酶解條件可以很好地結(jié)合于煙草打葉復(fù)烤工藝過程中，具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：復(fù)合酶：上部煙葉：淀粉：蛋白質(zhì)：響應(yīng)面法

烤煙的上部煙葉包括上二棚葉和頂葉，共6～7片，占整株煙葉總產(chǎn)量的30%-40%。上部煙葉葉片較厚，組織結(jié)構(gòu)較緊密，淀粉、蛋白質(zhì)等大分子成分含量過高，燃燒后具有煙氣濃度和勁頭大、刺激性大、雜氣重等缺點(diǎn)，工業(yè)可用性較差。

近年來的研究中，改善上部煙葉吸食品質(zhì)的方法主要有3種：生物酶法、化學(xué)添加法、微生物發(fā)酵法。其中，生物酶法因?yàn)闂l件溫和、易于操作、改善效果明顯，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定優(yōu)勢。外加復(fù)合酶在較溫和的條件下，將淀粉、蛋白質(zhì)以及果膠、纖維素（細(xì)胞壁物質(zhì)）等大分子物質(zhì)分解成低聚糖、半乳糖醛酸、還原糖、短肽和氨基酸等以減少煙草原料的刺激性和雜氣，改善吸食品質(zhì)，提高其在煙草行業(yè)中的使用價(jià)值。然而，由于不同來源的市售酶制劑酶活單位定義不同，無法比較不同來源酶制劑的作用效果，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)得出的酶制劑使用量和配方無法重現(xiàn)。因此，雖然已有較多酶法改善上部煙葉品質(zhì)的研究，但實(shí)際應(yīng)用較少。

本研究選擇4類生物酶（淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶），在對其進(jìn)行統(tǒng)一酶活評價(jià)的基礎(chǔ)上，以淀粉降解率和蛋白質(zhì)降解率為評價(jià)指標(biāo)，采用單因素法和響應(yīng)面法對復(fù)合酶量、酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以縮短酶解時(shí)間，與現(xiàn)代煙草加工工藝相協(xié)調(diào)，使上部煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)的含量降低，同時(shí)增加水溶性糖分及氨基酸，使上部煙葉中各化學(xué)成分比例相對協(xié)調(diào)，從而改善上部煙葉的雜氣、勁頭和刺激性，為提高上部煙葉品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

上部煙葉B2F：上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司提供，2014年產(chǎn)于貴州，煙葉經(jīng)切絲后用于酶解。鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、濃硫酸等，AR：酪蛋白、果膠、淀粉：半乳糖醛酸標(biāo)品。以上試劑均由中國國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司生產(chǎn)。

淀粉酶I，中溫淀粉酶BAN 0.8L（諾維信Novozymes生物技術(shù)有限公司）：淀粉酶II，高溫淀粉酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）：淀粉酶III，高溫淀粉酶（上海麥克林生化科技有限公司）：淀粉酶IV，低溫淀粉酶（江蘇銳陽生物科技有限公司）。蛋白酶I，中性蛋白酶0.8 L（諾維信Novozymes生物技術(shù)有限公司）：蛋白酶II，水解蛋白酶2.4 L（諾維信Novozymes生物技術(shù)有限公司）：蛋白酶III，中性蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）。果膠酶I，上海源葉生物科技有限公司：果膠酶II，江蘇銳陽生物科技有限公司。纖維素酶I，上海麥克林生化科技有限公司：纖維素酶II，江蘇銳陽生物科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

H2-2型電熱恒溫振蕩水浴箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司：TGL-16M型臺式高速離心機(jī)，湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司：Enspire 2300多標(biāo)記檢測系統(tǒng)（酶標(biāo)儀），美國PerkinElmer公司UV3000型紫外一可見光分光光度計(jì)，日本Himchi公司：MB45紅外水分測定儀，美國OHAUS儀器有限公司：FA1004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司：SKD-200凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；SKD-0892紅外智能消化爐，上海沛歐分析儀器有限公司。

1.3測定方法

1.3.1原料預(yù)處理

陳化后的上部煙葉經(jīng)松散回潮、切絲、烘絲后，制得試驗(yàn)用長度均勻的煙絲（水分約12.5%，以紅外水分測定儀測得）。

1.3.2煙絲的酶解精確稱取（25.00±0.02）g煙絲置于篩網(wǎng)，于65℃水浴箱中保溫回潮20 min，使煙絲水分含量約21%。將回潮結(jié)束的煙絲平鋪于干凈的20 cmx16 cm陶瓷托盤，按照一定料水比將酶液（pH 7.5磷酸緩沖液溶解并稀釋）均勻噴灑在煙絲上，噴灑過程中常翻動(dòng)煙絲使酶液混合均勻，以食品級密封袋密封好，于適當(dāng)溫度恒溫箱中酶解。酶解結(jié)束后，采用烘箱快速烘干至水分含量12.0%-12.5%，待測。

1.3.3復(fù)合酶制劑配方中酶種類的選擇在30～70℃范圍內(nèi)測試各種酶的活性變化，初步確定適合于多種酶類進(jìn)行反應(yīng)的溫度，以及在此溫度下活性較高的商品酶（淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶各1種）作為酶制劑的配方用酶，同時(shí)對酶的活性進(jìn)行統(tǒng)一評價(jià)。根據(jù)所確定的酶解溫度和酶種類，將1mL一定濃度的淀粉酶、果膠酶、纖維素酶分別與蛋白酶混合，在40℃下反應(yīng)30 min，迅速將混合體系置于冷水中冷卻，再測定各種酶的活性。以不添加蛋白酶的體系為對照，確定蛋白酶對其他酶活性的影響。

1.3.4單位復(fù)合酶制劑中各種酶添加量的確定以不同濃度的淀粉酶（2、5、10、30、50 U/g煙葉）、蛋白酶（100、250、500、1000、2000 U/g煙葉）、果膠酶（50、100、200、500、1000 U/g煙葉）、纖維索酶（50、100、150、200、300 U/g煙葉）分別以料水比20：1加料于煙絲，密封后于40℃恒溫酶解30 min，按1.3.2所述烘干至水分含量12.0%-12.5%，測定各樣品中相應(yīng)成分含量，根據(jù)結(jié)果確定單位復(fù)合酶中各種酶的添加量。

1.3.5

復(fù)合酶處理上部煙葉單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.3.4的試驗(yàn)結(jié)果選定復(fù)合酶配比，分別考察復(fù)合酶量（0.1、0.5、1、1.5、2單位）、緩沖液pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）、含水量（20%、30%、40%、50%、60%、80%）、酶解時(shí)間（0.5、1、2、4、6、8、10 h）對酶解效果的影響。

1.3.6響應(yīng)面優(yōu)化酶解煙葉樣品條件

使用軟件Design Expert 10.0.3中的Box-Behnken（BBD）中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析，設(shè)置以下4個(gè)因素復(fù)合酶用量（A）、緩沖液pH（B）、含水量（C）、酶解時(shí)間（D）1研究環(huán)境對酶解上部煙葉效果的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4因素3水平，響應(yīng)面分析及因素如表1，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7主要化學(xué)成分檢測方法還原糖、可溶性總糖及淀粉含量的測定參照文獻(xiàn)，蛋白含量測定參照GB 5009.5-2016方法，果膠含量的測定參照YC/T 346-2010方法，纖維素含量的測定參照范式（Van Soest）酸性洗滌纖維分析法。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次（n=3），試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 7.0和Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2結(jié)果

2.1酶制劑中適宜商品酶種類及酶解溫度

如圖1A所示，在40℃左右的環(huán)境下低溫淀粉酶（淀粉酶Ⅳ）的酶活性高于其他淀粉酶。圖1B示出，諾維信中性蛋白酶0.8 L（蛋白酶I）在45℃時(shí)活性相對于其他兩種蛋白酶制劑更高。果膠酶和纖維素酶的最大酶活均出現(xiàn)在40-50℃溫度范圍（圖1C，1D），而果膠酶I和纖維素酶II酶活更高。

綜合以上結(jié)果，在進(jìn)行復(fù)合酶處理上部煙葉實(shí)驗(yàn)中用于配制復(fù)合酶的各種酶制劑選定為：淀粉酶Ⅳ、蛋白酶I、果膠酶I、纖維素酶II。酶解溫度選擇40℃進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

經(jīng)30min蛋白酶I酶解處理后，在pH 7.5，40℃下各種酶活性如表2所示。與未經(jīng)蛋白酶處理的酶活性相比，分別添加蛋白酶I后對這些酶活性沒有顯著影響，說明蛋白酶對各種酶活性影響不大。因此在配制復(fù)合酶的過程中，蛋白酶I可以與3種酶制劑復(fù)配使用。由于其他三者均是針對專一性底物，相互間并無協(xié)同作用效果，因此，復(fù)合酶制劑中各類酶量配比可以由各種酶的單因素試驗(yàn)確定。

2.2單位復(fù)合酶制劑中的各種酶量配比

如表3所示，40℃下，當(dāng)?shù)矸勖柑砑恿繛?0 U/g時(shí)淀粉的降解效果最好。當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿窟_(dá)到500 U/g時(shí)，蛋白的降解率趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增大蛋白酶添加量對于蛋白質(zhì)降解率影響不大。當(dāng)果膠酶和纖維素酶添加量均達(dá)到200 U/g后，相應(yīng)成分的降解率趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增大酶添加量對于降解率影響不顯著。因此復(fù)合酶中單一酶的添加量依次為：淀粉酶Ⅳ30U/g煙葉，蛋白酶I 500U/g煙葉，果膠酶I 200U/g煙葉，纖維素酶II 200U/g煙葉，用指定pH的緩沖液將各酶制劑配制為復(fù)合酶液，定義為復(fù)合酶1單位。

2.3復(fù)合酶制劑處理上部煙葉的單因素試驗(yàn)結(jié)果

如圖2A所示，隨復(fù)合酶量的增加，淀粉降解率呈逐步升高趨勢，在復(fù)合酶量為1時(shí)趨于穩(wěn)定。蛋白質(zhì)和淀粉的降解率（圖2B）在pH 5-8范圍內(nèi)隨pH升高而升高，在pH 8-9時(shí)達(dá)到最高值。這可能與煙葉本身pH偏酸性（pH-5.5）有關(guān)，略高的pH起到了中和作用使最終pH維持在適合生物酶作用的范圍。

隨含水量增加（圖2C），上部煙葉中淀粉和蛋白的降解率呈升高趨勢。在水分含量達(dá)到60%時(shí)，煙葉中淀粉和蛋白的降解率趨于穩(wěn)定。隨酶解時(shí)間的延長（圖2D），淀粉和蛋白降解率都呈增加趨勢，淀粉降解率在6 h后逐步趨于穩(wěn)定，而蛋白降解率在4h后即趨于穩(wěn)定。

以上結(jié)果表明，反應(yīng)溫度40℃條件下，煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)的最優(yōu)酶解條件為：復(fù)合酶添加量1（淀粉酶Ⅳ30U/g煙葉，蛋白酶I 500U/g煙葉，果膠酶I 200U/g煙葉，纖維素酶11200U/g煙葉），緩沖液pH 8，煙葉含水量60%，酶解時(shí)間6h。

2.4響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用軟件Design Expert 10.0.3中的Box-Behnken（BBD）中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析，分別以淀粉降解率和蛋白質(zhì)降解率為響應(yīng)值，取復(fù)合酶量（A）、緩沖液pH（B）、含水量（C）、酶解時(shí)間（D）為因素設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

2.4.2淀粉降解率模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)采用Design-Expert軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到淀粉降解率對所選4個(gè)因素（即復(fù)合酶添加量、pH、含水量、酶解時(shí)間）的二次多項(xiàng)回歸方程為：淀粉降解率/%=19.46+0.73A+1.18B+0.75C+0.99D-0.43AB-0.69AC+0.36AD-1.17BC-0.60BD+1.26CD-2.93A2-4.4482-2.82C2-3.43D。

由表5方差分析結(jié)果和圖3目標(biāo)函數(shù)的響應(yīng)曲面圖可以看出，各因素對淀粉降解率的影響順序?yàn)椋壕彌_液pH>酶解時(shí)間>含水量>復(fù)合酶量，且緩沖液pH與含水量、含水量與酶解時(shí)間的交互作用顯著（P<0.05）。

2.4.3蛋白質(zhì)降解率模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)采用軟件對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到蛋白質(zhì)降解率對所選4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

由圖4和表6可知，各因素對蛋白質(zhì)降解率的影響順序?yàn)椋壕彌_液pH>酶解時(shí)間>含水量>復(fù)合酶量，與淀粉降解率中的影響一致，而且緩沖液pH與含水量、緩沖液oH與酶解時(shí)間的交互作用顯著（p<0.05），復(fù)合酶量與含水量、復(fù)合酶量與酶解時(shí)間、含水量與酶解時(shí)間的交互作用極顯著（p<0.0001）。

2.4.4酶解條件的優(yōu)化與驗(yàn)證

由表5和表6可知，兩個(gè)模型的p值均小于0.0001，失擬項(xiàng)p>0.05，表明失擬不顯著，且回歸模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)方法可靠。模型的確定系數(shù)R2和校正確定系數(shù)R2adi均大于0.9，且兩組值分別接近，表明模型預(yù)測值與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的相關(guān)性。兩個(gè)模型預(yù)測殘差平方和均大于10，說明兩個(gè)模型解釋變差的能力較強(qiáng)，總體擬合具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可分別用來預(yù)測復(fù)合酶對上部煙葉中的淀粉和蛋白質(zhì)降解率。

根據(jù)Design Expert 10.0.3軟件中0ptimization的Numerical功能，在模型濃度范圍內(nèi)選擇最低點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn)，使用最大值優(yōu)化，得到復(fù)合酶酶解上部煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的理論最佳條件（表7），在最佳理論條件下淀粉和蛋白質(zhì)降解率的預(yù)測值分別為為19.69%和20.19%。

由表7亦可知，淀粉和蛋白質(zhì)降解率最佳理論條件中各參數(shù)數(shù)值接近，考慮到實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件的便利，為同時(shí)能達(dá)到兩者的最高降解率，在40℃條件下，選擇復(fù)合酶量1.1、pH 7.7、含水量54%、酶解時(shí)間5.5 h，取3次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)和和重復(fù)性考察。如表8所示，試驗(yàn)測得淀粉降解率為19.54%，蛋白質(zhì)降解率為20.03%，相對誤差分別為0.76%和0.79%，試驗(yàn)值與預(yù)測值基本一致，說明該條件的優(yōu)化結(jié)果具有較高準(zhǔn)確率。該酶解條件下，果膠和纖維素等成分均有不同程度的降解，還原糖和可溶性總糖含量顯著增加。對最優(yōu)酶處理?xiàng)l件下所得煙絲樣品進(jìn)行感官評吸（表9），結(jié)果顯示，酶處理后的煙絲比未處理的煙絲樣品在雜氣、勁頭和刺激性等方面都有一定改善?？梢姡皂憫?yīng)面法優(yōu)化后的酶解條件處理上部煙葉后，蛋白質(zhì)、淀粉等主要大分子成分含量顯著降低，同時(shí)還原糖、可溶性總糖含量及施木克值顯著提高，上部煙葉中各化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性得到了明顯提升，對于提高上部煙葉品質(zhì)具有一定的意義。

3討論

上部煙葉中含量較高的大分子成分對其品質(zhì)影響較大。淀粉含量較高時(shí)，會影響燃燒速度，使燃燒不完全，產(chǎn)生糊焦味。蛋白質(zhì)含量高，在燃燒時(shí)會產(chǎn)生不良?xì)馕叮⑻岣邿煔鈖H值而增加煙氣勁頭和刺激性。纖維素有燒紙味：果膠有木質(zhì)氣，雜氣重、余味差、對口腔刺激性大，會改變煙氣狀態(tài)。此外在調(diào)制后的煙葉中，蛋白質(zhì)、淀粉會與纖維索、果膠質(zhì)等共存，且不易分離。而預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，加入果膠酶和纖維素酶可以大大增強(qiáng)蛋白酶、淀粉酶的降解效率。故將蛋白酶、淀粉酶與細(xì)胞壁降解酶（果膠酶、纖維素酶）結(jié)合使用，果膠酶和纖維素酶的作用為適度降解煙葉細(xì)胞壁，使淀粉酶和蛋白酶可以更為充分地起到降解作用。

文中酶解后煙葉中的還原糖、可溶性總糖含量的提高幅度高于淀粉、果膠、蛋白質(zhì)及纖維素的降解量，可能由于酶制劑在酶解過程中不僅作用于淀粉、果膠、纖維素等不溶性大分子成分，還會作用于其他多聚體或低聚體成分，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

本研究中經(jīng)優(yōu)化后的酶解最佳水分含量為54%（含煙葉本身12.5%的水分），在該水分條件下進(jìn)行煙絲噴灑試驗(yàn)，通過對比酶處理前后的評吸效果，不會造成煙絲香味物質(zhì)的損失。本研究所得復(fù)合酶制劑處理上部煙葉的酶解條件可用于打葉復(fù)烤階段，在打葉去梗及篩分之后的加料配葉過程利用現(xiàn)有加料設(shè)備進(jìn)行復(fù)合酶液的噴灑，并增加儲葉過程，在所優(yōu)化的條件下進(jìn)行酶解處理，以降低上部煙葉中的淀粉和蛋白質(zhì)含量，無須額外增加大規(guī)模的生產(chǎn)處理設(shè)備。在之后的煙片復(fù)烤階段，經(jīng)90℃左右復(fù)烤使煙葉中水分降低至12.5%左右，并將所添加的復(fù)合酶變性失活，可避免其在下一步的裝箱醇化過程中對煙葉品質(zhì)繼續(xù)產(chǎn)生影響。因此，本研究所述復(fù)合酶的添加及作用條件可以很好的結(jié)合于煙草的生產(chǎn)工藝過程中，具有較好的應(yīng)用前景。

本文所采用的響應(yīng)面分析法利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，并通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，以解決多變量問題，對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的得出具有非常重要的意義。由于復(fù)合酶和上部煙葉都是復(fù)合體系，底物和酶的種類較多，因此無法進(jìn)行簡單的酶動(dòng)力學(xué)分析，今后需考慮建立復(fù)雜的數(shù)學(xué)模型，對復(fù)合酶降解煙葉中大分子成分的動(dòng)力學(xué)展開更為深入的探討。

4結(jié)論

本研究在統(tǒng)一酶活評價(jià)的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，得出降解上部煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)的最佳條件為：復(fù)合酶量配比為：淀粉酶Ⅳ33u/g煙葉、蛋白酶I 550U/g煙葉、果膠酶I 220U/g煙葉、纖維素酶11220U/g煙葉，pH7.7、含水量54%、酶解時(shí)間5.5 h。此時(shí)淀粉和蛋白質(zhì)降解率分別為19.54%和20.03%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值基本一致，該酶解條件的優(yōu)化結(jié)果具有較高準(zhǔn)確率和可靠性。酶處理后，煙葉的雜氣、勁頭和刺激性明顯改善。上述研究成果為上部煙葉的品質(zhì)提升奠定了基礎(chǔ)。