李強(qiáng) 邱海燕　樂(lè)淵 夏西亞　唐良德　曾東強(qiáng) 付步禮　劉奎

摘要

本文建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS /MS）同時(shí)測(cè)定豇豆中啶蟲(chóng)脒、阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟啶蟲(chóng)胺腈、滅蠅胺、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯和烯酰嗎啉殘留量的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，采用ACQUITY_UPLCTMBEH C18色譜柱分離，應(yīng)用 UPLCMS /MS 正離子掃描進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明，在0.01～1 μg/mL 范圍內(nèi)，8種農(nóng)藥色譜峰面積與濃度均呈線性相關(guān)；3個(gè)添加水平下，回收率均在90%以上；8種農(nóng)藥在豇豆中的檢出限為0.08～1.81 μg /kg，定量限為0.024～0.603 μg/kg。在實(shí)際豇豆樣品檢測(cè)中檢測(cè)到5種農(nóng)藥殘留，本方法靈敏度高、速度快，可為檢測(cè)豇豆中8種農(nóng)藥殘留量提供參考。

關(guān)鍵詞

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 豇豆； 農(nóng)藥； 殘留

中圖分類號(hào)：

O 657.63

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017196

Analyzation of 8 pesticide residues in cowpea by ultra performance liquid

chromatographytandemmass spectrometry

LI Qiang1，2，3， QIU Haiyan1，2， LE Yuan4， XIA Xiya1，

TANG Liangde1，2， ZENG Dongqiang3， FU Buli1，2， LIU Kui1，2

（1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，

Haikou 571101， China； 2. Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops，

Ministry of Agriculture， Haikou 571101，China； 3.Key Laboratory of Agricultural Environment andAgricultural Products Safety， Guangxi University， Nanning 530005， China； 4. Analysis &Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China）

Abstract

An analytical method based on ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS） was used to analyze residues of acetamiprid， abamectin， emamectin benzoate， sulfoxaflor， cyromazine， difenoconazole， pyraclostrobin and dimethomorph in cowpea. The samples were homogenized and extracted with acetonitrile， the retention of target compounds was performed on an ACQUITY_UPLCTMBEH C18 column by gradient elution， the qualification and quantification were analyzed by spectrometry with electrospray ionization in positive mode. The results showed that the chromatographic peak area was linearly related to the concentration of pesticides in the range of 0.01-1 μg/ mL. Under the 3 adding levels， the recovery rate is above 90%. The limits of detection （LOD） and quantitation （LOQ） were 0.08-1.81 μg/kg and 0.024-0.603 μg /kg， respectively. 5 pesticides residues were detected in the actual cowpea samples. Taken together， the present study suggest that UPLCMS /MS method with high sensitivity and high speed can be recommended to be used for the analysis of the residues of 8 pesticides in cowpea.

Key words

UPLCMS/MS； cowpea； pesticides； residue

豇豆是三亞主要冬種蔬菜之一，三亞優(yōu)越的環(huán)境條件有利于各季節(jié)豇豆生長(zhǎng)，但同時(shí)也使得豇豆上各種病蟲(chóng)害發(fā)生猖獗，如苗期根腐病，成株期銹病、煤霉病和炭疽病等，蟲(chóng)害則以斑潛蠅和薊馬為害最嚴(yán)重[1]。據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r，大量的殺蟲(chóng)劑如啶蟲(chóng)脒、阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）、氟啶蟲(chóng)胺腈、滅蠅胺和殺菌劑苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯、烯酰嗎啉等在豇豆生長(zhǎng)過(guò)程中需多次重復(fù)使用。導(dǎo)致豇豆中農(nóng)藥殘留超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)很大，豇豆質(zhì)量安全受到威脅。因此，建立簡(jiǎn)單、快速、監(jiān)測(cè)項(xiàng)目范圍廣的農(nóng)藥殘留分析技術(shù)已成為近年來(lái)農(nóng)殘檢測(cè)的一個(gè)發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)[25]。

利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS） 同時(shí)測(cè)定豇豆生產(chǎn)中常用殺蟲(chóng)劑與殺菌劑等殘留的報(bào)道還很少，雖然有關(guān)啶蟲(chóng)脒、阿維菌素、氟啶蟲(chóng)胺腈的檢測(cè)方法相對(duì)多樣，如氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等，但存在前處理步驟繁瑣的弊端[69]。吳宇寬等[10]采用高效液相色譜-加熱電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法建立了同時(shí)測(cè)定蔬菜、水果中阿維菌素和甲維鹽的方法。章虎等[11]采用液相色譜法建立了同時(shí)測(cè)定稻米中阿維菌素和甲維鹽殘留的方法。本研究采用UPLCMS/MS方法，首次進(jìn)行豇豆上8種常用農(nóng)藥的最終殘留研究，為檢測(cè)豇豆中8種農(nóng)藥殘留量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆樣品：分別于2016年12月26日、2017年1月26日、2017年2月26日在海南省三亞市崖城鎮(zhèn)拱北村豇豆種植基地進(jìn)行采樣，3個(gè)批次共15個(gè)豇豆樣品（其中5個(gè)前期采摘樣品、5個(gè)中期采摘樣品、5個(gè)后期采摘樣品），分別勻漿混勻，-20℃冰箱冷凍保存待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)品：啶蟲(chóng)脒（acetamiprid）、阿維菌素（abamectin）、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（emamectin benzoate）、氟啶蟲(chóng)胺腈（sulfoxaflor）、滅蠅胺（cyromazine）、苯醚甲環(huán)唑（difenoconazole）、吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和烯酰嗎啉（dimethomorph）均購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。乙腈，美國(guó)Fisher公司；甲醇（HPLC級(jí)），美國(guó)Fisher公司；超純水和甲酸，美國(guó)SigmaAldrich公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)市售分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

HClass超高效液相色譜儀（美國(guó)WatersAcquity公司）、 AB SCIEX API4000+三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）、配電噴霧離子源（ESI） 與 EB28012電子天平（日本島津公司）、SB400 DTY 超聲波掃頻清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、Anke TDL40B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、QL901旋渦混合器（江蘇海門(mén)其林醫(yī)用儀器廠）、MilliQ 超純水儀（美國(guó)Millipore公司）、0.22 μm有機(jī)系濾膜（天津美瑞泰克公司）、超低溫冰箱（美國(guó)Kaltis公司）。

1.3 樣品前處理

稱取20 g已勻漿樣品于50 mL燒杯中，加入40 mL乙腈，勻漿2 min。倒入裝有5～7 g氯化鈉的具塞量筒中，振搖2 min， 靜置30 min。取1 mL上清液于2 mL離心管中，加入稀釋液（甲醇∶水=1∶1）1 mL，渦旋1 min，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取豇豆空白樣品，按1.3節(jié)的方法處理，用上清液分別溶解8種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，配制成各農(nóng)藥質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2和1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.5 檢測(cè)條件

色譜條件：ACQUITY_UPLCTMBEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫35℃；進(jìn)樣量5 μL； 流速0. 25 mL/min； 運(yùn)行時(shí)間10 min。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。在此條件下8種農(nóng)藥的保留時(shí)間見(jiàn)表2。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI（+）；正離子掃描模式；毛細(xì)管電壓： 2 800 V；離子源溫度：110℃；去溶劑氣溫度：350℃；去溶劑氣流量：900 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h；碰撞氣流速度：0.21 mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）分析的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

1.6 定量方法

在正離子模式測(cè)定條件下，分別將豇豆樣品溶液和基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。采用外標(biāo)法定量，以定性離子對(duì)為依據(jù)進(jìn)行定性，以定量離子對(duì)的峰面積計(jì)算樣品中待測(cè)物的含量。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和添加回收試驗(yàn)

取1.4節(jié)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5節(jié)的條件測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以監(jiān)測(cè)離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。向豇豆空白樣品中添加0.01、0.1和1 μg/mL的3個(gè)水平的8種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3節(jié)的前處理方法和1.5節(jié)的條件測(cè)定，每個(gè)水平重復(fù)5次，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

本試驗(yàn)以乙腈為提取溶劑。采用QuEChERS凈化方法，簡(jiǎn)單易行。與傳統(tǒng)的前處理方法比，QuEChERS方法省去了過(guò)柱、旋蒸和定容步驟，減少提取過(guò)程中農(nóng)藥殘留量的損失，檢測(cè)結(jié)果更能反映真實(shí)值。

2.2 質(zhì)譜條件選擇

采用1 mg/kg濃度的8種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液?jiǎn)吾樳M(jìn)樣，優(yōu)化質(zhì)譜條件。通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜后，產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]離子。確定母離子后，在SIM模式下優(yōu)化各目標(biāo)化合物的碎裂電壓。母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜，產(chǎn)生不同的離子碎片。在子離子掃描模式下，優(yōu)化碰撞能量，得到相應(yīng)的離子碎片。用于母離子定性和定量的優(yōu)化；優(yōu)化碰撞能量，使這2個(gè)特征碎片離子的響應(yīng)最大，最后得到8種化合物相應(yīng)的MRM離子對(duì)以及質(zhì)譜參數(shù)。

2.3 色譜條件選擇

當(dāng)流動(dòng)相中的水相為超純水時(shí)，質(zhì)譜對(duì)檢測(cè)化合物的靈敏度較低。向水相中加入1.0 mmol的乙酸銨溶液則可以極大地提高靈敏度。通過(guò)試驗(yàn)最終確定流動(dòng)相為甲醇和1.0 mmol的乙酸銨溶液，可以同時(shí)滿足8種農(nóng)藥的靈敏度和較好的峰形要求。

2.4 線性檢驗(yàn)

8種農(nóng)藥在0.01～1 μg/mL添加濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與濃度均呈線性相關(guān)，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3，說(shuō)明此方法可以用于豇豆中8種農(nóng)藥的定性定量分析，8種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5 檢出限、添加回收率和變異系數(shù)

根據(jù)空白樣品的基線噪聲值求其平均值， 得到樣品中啶蟲(chóng)脒、阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟啶蟲(chóng)胺腈、滅蠅胺、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯和烯酰嗎啉的檢出限分別為0.36、0.50、0.08、1.8、1.81、1、1、0.09 μg/kg。準(zhǔn)確性以添加回收率表示，精密度以同批次樣品回收率的變異系數(shù)表示。3組添加水平8種農(nóng)藥的添加回收率和變異系數(shù)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果表明， 5個(gè)前期樣品檢測(cè)出氟啶蟲(chóng)胺腈、滅蠅胺、啶蟲(chóng)脒、阿維菌素、烯酰嗎啉；5個(gè)中期樣品檢測(cè)出滅蠅胺、啶蟲(chóng)脒、烯酰嗎啉；5個(gè)后期樣品檢測(cè)出滅蠅胺和啶蟲(chóng)脒。檢出量見(jiàn)表5，其他3種農(nóng)藥均未檢出。MRM色譜圖見(jiàn)圖2。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用改進(jìn)的QuEChERS方法提取和凈化樣品，利用UPLCMS/MS快速檢測(cè)豇豆中8種農(nóng)藥殘留，其色譜峰分離效果好，操作簡(jiǎn)單，檢出限0.08～1.81 μg/kg，定量限為0.024～0.603 μg/kg，且在10 min內(nèi)即可完成8種農(nóng)藥多殘留分析。該方法平均回收率均在90%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10%，完全符合農(nóng)藥殘留分析的要求。此外，該方法與現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)相比，在實(shí)際應(yīng)用中效果更好，更適合大量豇豆樣品的檢測(cè)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）