章淑玲 林谷園 肖順

摘要 花生莖線蟲Ditylenchus arachis是危害花生的重要病原線蟲。本研究通過測試不同真菌和培養(yǎng)溫度對花生莖線蟲繁殖力的影響，以探討該線蟲在室內(nèi)的培養(yǎng)條件。研究結(jié)果表明：花生莖線蟲在長柄鏈格孢、茄鐮孢、尖鐮孢和灰葡萄孢上均能完成生活史并進行繁殖，但不同真菌上培養(yǎng)線蟲的效果不同。其中長柄鏈格孢的培養(yǎng)效果最好，培養(yǎng)30 d后的總蟲量和繁殖系數(shù)分別為37 292條和1 243倍；灰葡萄孢的培養(yǎng)效果最差，30 d后的總蟲量和繁殖系數(shù)僅為1 514條和50倍。25～30℃是花生莖線蟲的適宜培養(yǎng)溫度，30℃時為最佳溫度；當溫度低于20℃或高于35℃時線蟲繁殖效果差。此方法繁殖的線蟲可用于花生莖線蟲生物學、遺傳學等方面的研究。

關(guān)鍵詞 花生莖線蟲； 真菌； 溫度； 繁殖力

中圖分類號： S435.652

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017288

Abstract Ditylenchus arachis is one of the important damaging nematodes of peanut in China. In order to study the cultural conditions on fungi in the laboratory， the effects of different fungi and different cultural temperatures on the reproductive capability of D.arachis were evaluated. The results showed that D.arachis could complete its life cycle and reproduce on Alternaria longipes， Fusarium solani， F. oxysporum and Botrytis cinerea， but the effects of different fungi varied. The reproductive capability of D.arachis was the highest on A.longipes， with a total number of nematodes and reproduction rate of 37 292 and 1 243， respectively. The total number of nematodes and reproduction rate were the lowest on B.cinerea （only 1 514 and 50， respectively）. The optimum temperatures for D.arachis on fungi were from 25℃ to 30℃， and 30℃ was the best cultural temperature. D.arachis could not reproduce well at temperatures lower than 20℃ or greater than 35℃. D.arachis cultured by this method can be used for biological and genetic studies on this nematode.

Key words Ditylenchus arachis； fungus； temperature； reproduction capability

花生莖線蟲病于1987年在南非的德蘭士瓦?。═ransvaal）的花生莢果上首次發(fā)現(xiàn)，其后在南非所有的花生主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，受侵染的花生通常減產(chǎn)20%～50%，是南非花生上最重要的線蟲病害，病原經(jīng)鑒定為非洲莖線蟲Ditylenchus africanus[14]。2014年本實驗室在我國山東、河北兩省的多個花生主產(chǎn)區(qū)首次發(fā)現(xiàn)了花生莖線蟲病害，病原經(jīng)形態(tài)學、分子生物學及致病性測定，確定為一種莖線蟲新種——花生莖線蟲Ditylenchus arachis[5]。該線蟲可侵染花生的根系、胚栓、果莢和種粒，致使受害后的花生根系減少、腐爛，結(jié)莢少，固氮根瘤菌減少，果莢外殼變黑、腐爛，種皮褐變、皺縮，嚴重降低了花生的產(chǎn)量和品質(zhì)[56]。因此，花生莖線蟲是繼根結(jié)線蟲Meloidogyne spp.后又一個對中國花生生產(chǎn)造成重要影響的病原線蟲[7]。為了進一步研究該線蟲的生物學、致病機理、種群間的遺傳特性及防治技術(shù)，需要快速獲得大量的、具有較強生命力的病原線蟲群體。目前常用于線蟲培養(yǎng)的方法有寄主接種法、離體組織培養(yǎng)法和真菌培養(yǎng)法等[8]。本研究采用真菌培養(yǎng)線蟲的方法，分別測試不同真菌和培養(yǎng)溫度對花生莖線蟲繁殖力的影響，以探討花生莖線蟲人工培養(yǎng)的最適條件。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試的花生莖線蟲6個地理種群（編號Dar01～Dar06）分別來自河北邢臺、河北遷安、山東萊蕪、山東費縣、山東聊城和江蘇宿州的花生莖線蟲病果莢，病果莢中的莖線蟲經(jīng)改良貝爾曼漏斗法分離取得[9]。

供試的長柄鏈格孢Alternaria longipes、尖鐮孢Fusarium oxysporum、茄鐮孢F. solani及灰葡萄孢 Botrytis cinerea采用組織分離法從福建的煙草、香蕉、山藥及番茄上分離獲得[10]。

1.2 線蟲的消毒

分離出的線蟲懸浮液經(jīng)沉降后收集于1.5 mL eppendorf管中，3 000 r/min離心2 min，去上清液；加入0.1%硫酸鏈霉素溶液，進行表面消毒10 min；再用無菌水清洗2～3次，備用。

1.3 真菌培養(yǎng)基的制備

PDA試管斜面的制備：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

在超凈工作臺內(nèi)將不同真菌分別接種于滅菌后的PDA斜面試管中，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，待用。

1.4 真菌培養(yǎng)花生莖線蟲

1.4.1 不同真菌對花生莖線蟲培養(yǎng)的影響

分別吸取已消毒并清洗的30條河北邢臺花生莖線蟲（Dar01）雌蟲接種到長滿真菌的PDA斜面試管中，每種菌設(shè)20個重復，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行黑暗培養(yǎng)30 d。30 d后分離計數(shù)試管中培養(yǎng)的花生莖線蟲數(shù)。

1.4.2 不同培養(yǎng)溫度對花生莖線蟲的影響

挑取已消毒并清洗的30條河北省邢臺花生莖線蟲（Dar01）雌蟲接種于長滿長柄鏈格孢的PDA斜面試管中，分別置于15、20、25、30℃和35℃的恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，每處理設(shè)20個重復，測定不同培養(yǎng)溫度下花生莖線蟲的繁殖力。

1.4.3 不同地理種群間花生莖線蟲的繁殖力測定

分別挑取已消毒并清洗的30條6個不同地理種群的花生莖線蟲，按1.4.1的方法接種于長滿長柄鏈格孢的PDA斜面試管中，每個地理種群設(shè)20個重復。培養(yǎng)30 d后分離計數(shù)其中的花生莖線蟲數(shù)。

1.5 線蟲的分離與統(tǒng)計

往培養(yǎng)到期的真菌斜面試管中加入無菌水進行反復沖洗，將試管壁及真菌中的花生莖線蟲盡可能地洗出。洗出的線蟲懸浮液經(jīng)沉降后收集到10 mL的離心管中，3 000 r/min離心2 min，最后定容至1 mL。用100 μL移液管吸取20 μL線蟲懸浮液于載玻片上，在體視顯微鏡下分別統(tǒng)計卵、幼蟲、雄蟲、雌蟲的數(shù)量，重復3次取平均值。最后根據(jù)定容的體積計算出每個接種重復的總蟲數(shù)。線蟲的繁殖系數(shù)（Rr）=最終線蟲量（Pf）/起始線蟲量（Pi）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS PASW Statistics v18.0 軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行方差分析，并采用Duncan氏新復極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類的真菌對花生莖線蟲繁殖力的影響

從圖1可看出，花生莖線蟲（Dar01）接種于4種不同真菌于28℃黑暗培養(yǎng)30 d后，均可見斜面試管中的菌絲相比接種前（圖1a，c，e，g）已被線蟲大量取食（圖1b，d，f，h），用體視顯微鏡觀察可見試管壁上有大量的線蟲團（圖1i），說明供試的4種真菌均可用于花生莖線蟲的人工室內(nèi)培養(yǎng)。但在不同種類真菌上花生莖線蟲的繁殖力表現(xiàn)出顯著的差異（表1）：花生莖線蟲在長柄鏈格孢上培養(yǎng)的效果最好，30 d后各蟲態(tài)數(shù)量分別為卵704個、幼蟲34 592條、雌蟲972條、雄蟲1 024條，蟲口總數(shù)達37 292條，繁殖系數(shù)為1 243倍；其次是茄鐮孢和尖鐮孢，其繁殖系數(shù)分別為541倍和429倍；灰葡萄孢培養(yǎng)的效果最差，30 d后花生莖線蟲的總蟲數(shù)僅1 514條，繁殖系數(shù)為50倍，與以上3種真菌的繁殖力存在顯著差異。

2.2 不同培養(yǎng)溫度對花生莖線蟲繁殖力的影響

從表2可以看出，溫度對花生莖線蟲在長柄鏈格孢上的繁殖有很大的影響。15℃下培養(yǎng)30 d后雖可見少數(shù)幼蟲和雄蟲，但卵和雌蟲的數(shù)量為0，說明當溫度≤15℃時花生莖線蟲不能順利地完成生活史。在25～30℃的培養(yǎng)溫度之間，隨著溫度的升高，花生莖線蟲的幼蟲、成蟲數(shù)量在不斷增加，說明其繁殖力在不斷地升高，尤其當溫度達到30℃時花生莖線蟲的總數(shù)達到了最高值43 120條，繁殖系數(shù)也達到了1 437倍，說明30℃是花生莖線蟲繁殖的最佳溫度。溫度高于30℃后花生莖線蟲的繁殖能力隨之下降，當溫度升高到35℃時，花生莖線蟲的繁殖力與15℃和20℃時差異不顯著。

2.3 不同地理種群間花生莖線蟲的繁殖力測定

將6個不同地理種群的花生莖線蟲各30條接種于長柄鏈格孢上，于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，從表3可以看出，30 d后各個地理種群都能成功繁殖并順利完成生活史，6個地理種群的花生莖線蟲在各個不同蟲態(tài)上發(fā)育數(shù)量雖存在一定差異，但其總蟲數(shù)及其繁殖系數(shù)不存在顯著差異。

3 結(jié)論與討論

莖線蟲屬線蟲是一類十分重要的植物寄生線蟲，其中的多個種已被證實對作物造成了重大的危害，如腐爛莖線蟲D.destructor、鱗球莖莖線蟲D.dipsaci、巨大莖線蟲D.gigas、水稻莖線蟲D.angustus和非洲莖線蟲D.africanus[34， 1113]?；ㄉo線蟲D. arachis是在我國花生生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)的重要新病原。本試驗首次探討花生莖線蟲在真菌上的培養(yǎng)條件，以此快速獲取大量線蟲樣本，為后續(xù)開展花生莖線蟲的相關(guān)特征研究提供基礎(chǔ)保障。

本研究結(jié)果表明，花生莖線蟲在長柄鏈格孢、茄鐮孢、尖鐮孢和灰葡萄孢這4種真菌上均能完成各自的生活史并進行有效的繁殖。但在不同種類真菌上的培養(yǎng)效果有較大的差異，其中在長柄鏈格孢上繁殖的效果最好，最適合用于花生莖線蟲的大量快速培養(yǎng)，同時該菌也可用于腐爛莖線蟲D.destructor和水稻干尖線蟲Aphelenchoides besseyi的大量培養(yǎng)[1415]；其次是茄鐮孢和尖鐮孢；灰葡萄孢作為常用的線蟲培養(yǎng)菌[1618]在本研究中的培養(yǎng)效果最差，其原因是否為該分離菌株存在分化變異還有待進一步研究。不同的培養(yǎng)溫度對花生莖線蟲的繁殖同樣有較大的影響，30℃是真菌培養(yǎng)花生莖線蟲的最佳溫度，溫度低于20℃或高于35℃都不利于該線蟲的繁殖。不同地理種群的花生莖線蟲在繁殖力上不存在顯著差異，這可能也說明我國花生莖線蟲在種群間比較保守而不存在明顯的地理變異，這一研究結(jié)果對今后進一步研究花生莖線蟲的種群遺傳多樣性有一定的參考價值。

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（責任編輯：田 喆）