嚴(yán)丹侃 鄭紅英 張海珊 沈艷 顧江濤　章東方　燕飛

摘要

利用酶聯(lián)免疫和RTPCR技術(shù)對(duì)采自安徽地區(qū)的蠶豆病株進(jìn)行檢測(cè)，確定其病原為蠶豆萎蔫病毒2號(hào)Broad bean wilt virus 2 （BBWV2）。為明確BBWV2安徽分離物（BBWV2AH）的分類地位，克隆了該分離物的全基因組序列，分析了其基因組特征。結(jié)果表明，BBWV2AH RNA1全長(zhǎng)為5 944 bp （GenBank登錄號(hào)： KY606992），含有1個(gè)ORF；BBWV2AH RNA2全長(zhǎng)3 587 bp （GenBank登錄號(hào)： KY606993），含有1個(gè)ORF。全序列核苷酸和氨基酸相似性分析顯示，BBWV2AH RNA1與BBWV2其他分離物的核苷酸、氨基酸相似性分別為78.4%～96%和87.1%～99%；BBWV2AH RNA2與BBWV2其他分離物的核苷酸、氨基酸相似性分別為76.8%～95.5%和88.2%～98.3%。全基因組核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，BBWV2AH RNA1與中國(guó)的BBWV2Hunan RNA1的親緣關(guān)系最近，而BBWV2AH RNA2與韓國(guó)的多個(gè)分離物聚集在一起，再與中國(guó)的分離物BBWV2B935形成一個(gè)分支。

關(guān)鍵詞

蠶豆萎蔫病毒2號(hào)； 安徽分離物； 基因組； 序列分析

中圖分類號(hào)：

S 435.23

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017158

Identification and analysis of complete genomic sequence of

Broad bean wilt virus 2 Anhui isolate

YAN Dankan1， ZHENG Hongying2， ZHANG Haishan1， SHEN Yan1，

GU Jiangtao1， ZHANG Dongfang1， YAN Fei2

（1. Institute of Plant Protection and AgroProducts Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， China；

2. Institute of Virology and Biotechnology， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310021， China）

Abstract

BBWV2 was detected from broad bean plants in Anhui Province by DASELISA and RTPCR.To further characterize the BBWV2 Anhui isolate （BBWV2AH）， complete nucleotide sequence of BBWV2AH was determined.Sequence analysis suggested that BBWV2AH RNA1 was comprised of 5 944 nucleotides， encoding one ORF （GenBank accession no. KY606992）； BBWV2AH RNA2 was comprised of 3 587 nucleotides， also encoding one ORF （GenBank accession no. KY606993）. The comparison of nucleotide sequences suggested that RNA1 and RNA2 of BBWV2AH shared 78.4%-96% and 76.8%-95.5% nucleotide sequence identity with those of other BBWV2 isolates， respectively. Furthermore，the comparison of amino acid sequences suggested that RNA1 and RNA2 of BBWV2AH shared 87.1%-99% and 88.2%-98.3% amino acid sequence identity with those of other BBWV2 isolates， respectively. Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences showed that RNA1 of BBWV2AH isolate was most closely related to BBWV2Hunan isolate， while RNA2 of BBWV2AH formed an independent branch with several Korean isolates， and was then closely related to BBWV2B935 from China.

Key words

Broad bean wilt virus 2； Anhui isolate； complete genome； sequence analysis

蠶豆是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，我國(guó)2014年蠶豆收獲面積為92.5萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量為159.5萬(wàn)t，是世界蠶豆生產(chǎn)第一大國(guó)，產(chǎn)量占世界蠶豆總產(chǎn)量的36.7%[1]。蠶豆萎蔫病毒Broad bean wilt virus （BBWV）是危害蠶豆的主要病毒，該病毒為豇豆花葉病毒科Comoviridae蠶豆病毒屬Fabavirus的典型種，其基因組由2條單鏈RNA分子組成，分別是60 kb的RNA1和3.6 kb的RNA2。BBWV有2種血清型，依據(jù)血清型差異將其區(qū)分為2個(gè)種，即BBWV1和BBWV2[2]。

我國(guó)尚未見到BBWV1發(fā)生報(bào)道，而BBWV2則普遍發(fā)生。BBWV2通過汁液摩擦或蚜蟲以非持久性方式傳播，不僅能侵染豆類作物[34]、蔬菜、煙草、花卉和中草藥[57]，還能侵染葡萄等多種木本植物，引起花葉、矮化、萎蔫和植株枯死，造成嚴(yán)重危害[8]。周雪平等[9]測(cè)定了BBWV2中國(guó)分離物 （B935） 的全基因序列，并對(duì)其基因表達(dá)及蛋白功能進(jìn)行了深入分析。牛顏冰等[10]對(duì)山西太谷范村蔬菜種植基地的青椒病害進(jìn)行調(diào)查，

明確青椒病毒病病原為BBWV2，并獲得BBWV2青椒分離物（BBWV2Ca）的基因組全序列。王曉燕[11]完成侵染一串紅的BBWV2分離物S4的分子鑒定和基因組測(cè)定，明確其與已報(bào)道的BBWV2、辣椒分離物XJP11和番茄分離物XJ143a的序列差異。本研究對(duì)侵染安徽蠶豆的病毒分離物BBWV2進(jìn)行了鑒定，報(bào)道了BBWV2安徽蠶豆分離物（BBWV2AH）的基因組全序列，并與已報(bào)道的BBWV2分離物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，為研究BBWV2的基因遺傳和變異提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒病樣：2016年3月，蠶豆病樣采集于安徽省長(zhǎng)豐縣崗集鎮(zhèn)安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院崗集試驗(yàn)基地，保存于-70℃冰箱中備用。

主要試劑：Mini BEST Plant RNA Extraction Kit和PrimeScriptTMOne Step RTPCR Kit購(gòu)自TaKaRa公司，克隆載體pUCmT和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，蠶豆萎蔫病毒檢測(cè)試劑盒（DASELISA）購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。

引物：用于BBWV2AH全基因組序列擴(kuò)增的10對(duì)引物（表1）參考牛顏冰等[7]和HaeRyun Kwa[1213]的報(bào)道。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

病毒RNA：使用Mini BEST Plant RNA Extraction Kit提取100 mg蠶豆葉片的總RNA，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

蠶豆萎蔫病毒檢測(cè)試劑盒（DASELISA）檢測(cè)參照說明書進(jìn)行。

BBWV2AH全基因組序列的RTPCR擴(kuò)增：以BBWV2AH侵染發(fā)病的蠶豆葉片組織總RNA為模板，按照PrimeScriptTM One Step RTPCR Kit說明書，以蠶豆萎蔫病毒外殼蛋白大亞基基因引物和覆蓋BBWV2全基因組序列的RNA1的6對(duì)引物和RNA2的4對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1）。在1×TAE電泳緩沖液中，經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離PCR產(chǎn)物。

BBWV2AH全基因組序列的克隆和測(cè)序：使用UNIQ10柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物并純化，再與pUCmT載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α后培養(yǎng)，每個(gè)片段選取多個(gè)克隆進(jìn)行鑒定，將陽(yáng)性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，每個(gè)片段通過比對(duì)選擇3個(gè)測(cè)序結(jié)果相同的序列作為最終測(cè)序結(jié)果，拼接測(cè)序結(jié)果，獲得BBWV2AH全基因組序列。

BBWV2AH全基因組序列分析：從GenBank中獲得BBWV2其他39個(gè)分離物全基因組序列，以同屬的廣藿香輕型花葉病毒Patchouli mild mosaic virus（PatMMV）[1415]和蠶豆萎蔫病毒1號(hào)Broad bean wilt virus 1（BBWV1）[16]為外群，根據(jù)其基因組RNA1和RNA2序列，使用DNAstar軟件中的MegAlign進(jìn)行開放閱讀框及非編碼區(qū)序列比對(duì)分析，使用MEGA 6.0[17]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，采用鄰位相接聚類分析法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用1 000次重復(fù)的自展檢驗(yàn)評(píng)價(jià)系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆萎蔫病毒及其外殼蛋白大亞基基因（LCP）的檢測(cè)

使用蠶豆萎蔫病毒檢測(cè)試劑盒（DASELISA）對(duì)采集自安徽的蠶豆病株葉片和健康葉片進(jìn)行檢測(cè)。病株葉片檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)黃色，為陽(yáng)性，表明其中含有蠶豆萎蔫病毒；而健康葉片檢測(cè)結(jié)果為透明，為陰性，表明不含蠶豆萎蔫病毒。使用BBWV2的外殼蛋白大亞基基因（large coat protein，LCP）引物BBWV2 LCPF和BBWV2 LCPR從蠶豆病株葉片中可擴(kuò)增出約1 200 bp的條帶，而健康蠶豆葉片未擴(kuò)增出條帶（圖1），對(duì)擴(kuò)增得到的條帶進(jìn)行克隆后測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果顯示為蠶豆萎蔫病毒2號(hào)外殼蛋白大亞基基因（LCP）。

2.2 BBWV2AH基因組全序列的克隆與測(cè)定

2.2.1 BBWV2AH RNA1的克隆

為明確BBWV2安徽分離物BBWV2AH的分類地位，以提取的蠶豆病株葉片RNA為模板，分別以BBWV211u/BBWV211r、BBWV212f/BBWV212r、BBWV2（RNA1）F2/BBWV2（RNA1）R2、BBWV2（RNA1）F3/BBWV2（RNA1）R3、BBWV2（RNA1）F4/BBWV2（RNA1）R4和BBWV2（RNA1）F5/BBWV2（RNA1）R5為引物進(jìn)行BBWV2AH RNA1克隆。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分別得到大小為1 081、1 076、881、1 084、1 562 bp和1 767 bp的目的片段（圖2），測(cè)序后進(jìn)行序列拼接，獲得BBWV2AH RNA1全長(zhǎng)為5 944 bp，含有1個(gè)ORF，始于216 bp，終止于5 828 bp，

2.2.2 BBWV2AH RNA2的克隆

以蠶豆病株葉片總RNA為模板，分別以BBWV2（RNA 2）1F/BBWV2（RNA 2）1R、BBWV2（RNA 2）2F/BBWV2（RNA 2）1d、BBWV2（RNA 2）2u/BBWV2（RNA 2）2r和BBWV2（RNA 2）3u/BBWV2（RNA 2）3d為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分別得到大小為951、875、1 092 bp和1 136 bp的目的片段（圖3），測(cè)序后序列拼接分析表明BBWV2AH RNA2全長(zhǎng)3 587 bp，含有1個(gè)ORF，始于209 bp，終止于3 406 bp，編碼1 065個(gè)氨基酸。

2.3 BBWV2AH分離物基因組序列分析

利用DNAStar軟件對(duì)BBWV2AH RNA1（KY606992）全序列與來(lái)自韓國(guó)、中國(guó)、日本、新加坡和菲律賓的39個(gè)BBWV分離物進(jìn)行核苷酸序列、氨基酸序列同源性分析。BBWV2AH RNA1與BBWV2其他分離物核苷酸同源性為78.4%～96%，氨基酸同源性為87.1%～99%。與來(lái)自中國(guó)湖南的分離物BBWV2Hunan RNA1 （KJ789403.1）核苷酸、氨基酸同源性均為最高；與外群PatMMVPhilippines分離物RNA1 （NC003975）核苷酸、氨基酸同源性為89.3%和95.7%；與BBWV1Ben分離物RNA1 （AY781171）核苷酸、氨基酸同源性分別為64.4%和60.6%（表2）。

將BBWV2AH RNA2（KY606993）與來(lái)自中國(guó)、韓國(guó)、日本、新加坡和菲律賓的18種分離物進(jìn)行核苷酸序列、氨基酸序列同源性分析。BBWV2AH RNA2與BBWV2其他分離物核苷酸同源性為76.8%～95.5%、氨基酸同源性為88.2%～98.3%。與韓國(guó)BBWV2RP4分離物RNA2 （JX183228.1）核苷酸同源性最高、與中國(guó)分離物BBWV2B935 RNA2 （AJ132844）和韓國(guó)分離物BBWV2RP5 RNA2 （JX183230.1）氨基酸同源性最高；與外群PatMMVPhilippines分離物的RNA2（NC003974）核苷酸、氨基酸同源性為83.9%和91.9%；與BBWV1Ben分離物RNA2 （AY781172）的核苷酸、氨基酸同源性分別為56.2%和58.3%（表2）。

2.4 BBWV2AH與其他分離物系統(tǒng)進(jìn)化分析

為研究BBWV2AH的起源與進(jìn)化關(guān)系，以同屬的BBWV1Ben和PatMMVPhilippines為外群，分別構(gòu)建該分離物與已報(bào)道的BBWV2分離物的RNA1和RNA2核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4～5）。從進(jìn)化樹上可以看出，BBWV2AH RNA1與中國(guó)的BBWV2Hunan的親緣關(guān)系最近，并與中國(guó)的分離物BBWV2B935、BBWV2SG1、BBWV2XJP11、BBWV2Ca和BBWV2XJ143，韓國(guó)的分離物BBWV2LS2、BBWV2DO、BBWV2BBWVBRI、BBWV2SN、BBWV2K、BBWV2RP3、BBWV2BB5、BBWV2P2、BBWV2P3和日本的分離物BBWV2MB7、BBWV2IA聚集成一個(gè)大支。而韓國(guó)的其他分離物和新加坡的BBWV2ME分離物成一大支。以上兩支與西班牙的BBWV1Ben分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

從構(gòu)建的BBWV2 RNA2系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）可以看出BBWV2AH分離物與韓國(guó)的分離物BBWV2RP1（JX183222）、BBWV2RP1（KT380023）、BBWV2RP2、BBWV2GP2、BBWV2GP4、BBWV2GP5、BBWV2RP5、BBWV2SP1、BBWV2SP2、BBWV2RP6、BBWV2BB9、BBWV2RP3、BBWV2RP4、BBWV2BB5、BBWV2PAP3、BBWV2PAP2、BBWV2PAP1、BBWV2P2、BBWV2P3、BBWV2SP以及中國(guó)的分離物BBWV2B935形成一個(gè)獨(dú)立分支，親緣關(guān)系最近。該分支再與韓國(guó)的分離物BBWV2K、BBWV2SN、BBWV2DO、BBWV2BBWVBRI，中國(guó)的分離物BBWV2XJ143、BBWV2Hunan、BBWV2SG1和日本的分離物BBWV2IA、BBWV2MB7形成一個(gè)大支。其他的分離物形成另一大支，與BBWV2AH親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。以上兩個(gè)分支均與西班牙的BBWV1Ben分離物親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論

BBWV2寄主范圍廣，在蠶豆、辣椒、番茄等上均有發(fā)生，是我國(guó)豆科作物和一些重要蔬菜作物上的主要病毒病。蠶豆被病毒侵染后往往出現(xiàn)花葉、矮化、萎蔫直至枯死等癥狀，導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻，產(chǎn)量和品質(zhì)下降。作者通過酶聯(lián)免疫和外殼蛋白大亞基基因的RTPCR法對(duì)田間具有明顯矮縮、萎蔫癥狀的蠶豆進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了蠶豆萎蔫病毒2號(hào)存在，并克隆、測(cè)定了BBWV2安徽分離物（BBWV2AH）全基因組序列。

為進(jìn)一步明確BBWV2AH的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將BBWV2AH RNA1與39個(gè)不同來(lái)源的BBWV2進(jìn)行核苷酸序列、氨基酸序列同源性比較分析。結(jié)果表明，我們從蠶豆上鑒定的BBWV2AH 分離物的RNA1與湖南的辣椒分離物BBWV2Hunan核苷酸、氨基酸同源性均為最高，而RNA2則與韓國(guó)辣椒分離物BBWV2RP4的核苷酸同源性最高、與中國(guó)蠶豆分離物BBWV2B935和韓國(guó)辣椒分離物BBWV2RP5的氨基酸同源性最高。進(jìn)一步將獲得的安徽分離物BBWV2AH全基因組序列和39個(gè)蠶豆病毒屬分離物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)BBWV2AH RNA1與中國(guó)的BBWV2Hunan RNA1的親緣關(guān)系最近，而BBWV2AH RNA2與韓國(guó)的多個(gè)分離物聚集在一起，再與中國(guó)的分離物BBWV2B935形成一個(gè)分支，與序列同源性分析結(jié)果基本一致。BBWV分離物RNA1和RNA2在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及聚類分析中表現(xiàn)的差異是否與該病毒在田間容易通過蚜蟲在不同種類的寄主植物間傳播相關(guān)？該病毒在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中是否通過重組或重排以適應(yīng)多種不同寄主植物并擴(kuò)展其寄主范圍等問題還需要進(jìn)一步研究。

本研究測(cè)定了BBWV2安徽分離物（BBWV2AH）全基因組序列，分析了其與已報(bào)道的BBWV2其他分離物的序列差異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了BBWV2 RNA1和RNA2與其他分離物聚類分析時(shí)的差異，為揭示該病毒的基因組進(jìn)化方式提供了信息。

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（責(zé)任編輯：田 喆）