管陽凡，樊 凱，張金凱，高士杰，鄭錦彪

(上海曉明檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 200335)

吡唑醚菌酯是巴斯夫公司于1993年發(fā)現(xiàn)的一種新型甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式示于圖1。它不僅廣譜、高效，而且對作物具有保健增產(chǎn)的作用，是美國環(huán)保署就此功能登記的第一個產(chǎn)品[1]。自2002年吡唑醚菌酯上市至今，在殺菌劑中它的銷售額穩(wěn)居前5名[2]。國內(nèi)對吡唑醚菌酯原藥和復(fù)配制劑的研發(fā)[3-6]、登記需求也持續(xù)高漲，關(guān)于吡唑醚菌酯原藥中常見雜質(zhì)的定性分析已成為關(guān)注的熱點。

圖1 吡唑醚菌酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of pyraclostrobin

近幾年，HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于原料藥的雜質(zhì)分析中，包括對已知雜質(zhì)的定量分析和未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析[7-9]。但對于鑒定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，或區(qū)分一些同分異構(gòu)體，LC/MS譜所提供的信息尚不充分，還需要借助MS/MS[10-12]、NMR、IR、X射線衍射等技術(shù)，或采用相似化合物譜圖對照[13]的方法進一步分析。高能誘導(dǎo)裂解(higher energy collision induced dissociation, HCD)是一項新型的裂解技術(shù)，結(jié)合高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可用于化合物結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜裂解機理的推測。解析雜質(zhì)譜圖信息后，通常用雜質(zhì)對照品進行色譜對照，以便驗證所得結(jié)論的準確性。

本實驗擬利用UPLC-MS法分析實驗室合成的吡唑醚菌酯原藥，運用高能誘導(dǎo)裂解質(zhì)譜(HCD MS/MS)法對原藥中存在的主要雜質(zhì)進行解析，并通過與對照品比對驗證結(jié)論的準確性。希望為吡唑醚菌酯中雜質(zhì)的定性分析提供方法參考，并為其他甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑中雜質(zhì)的解析提供方法借鑒。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Acquity UPLC H-Class超高壓液相色譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；Dionex Ultra 3000型超高壓液相色譜儀，Q-ExactiveTM組合型四極桿-高分辨軌道阱質(zhì)譜儀，Xcalibur工作軟件：美國Thermo-fisher公司產(chǎn)品；十萬分之一天平：德國賽多利斯公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

乙腈：HPLC級，Tedia公司產(chǎn)品；吡唑醚菌酯原藥：含量≥97%，由實驗室參照文獻[4]的方法合成；實驗用水：Milli-Q超純水。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動相：A為乙腈，B為超純水；梯度洗脫程序：0～2 min(40%A)，2～12 min(40%～60%A)，12～18 min(60%A)，18～25 min(60%～90%A)，25～30 min(90%A)，30～30.01 min(90%～40%A)，30.01～36 min(40%A)；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL；全波長掃描模式。

1.3.2質(zhì)譜條件 ESI源正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000；一級質(zhì)譜采用全掃描模式，二級質(zhì)譜采用平行反應(yīng)監(jiān)測(parallel reaction monitoring, PRM)模式；噴霧電壓：3.5 kV；離子傳輸管溫度：320 ℃；金屬噴針溫度：300 ℃；鞘氣壓強：241 kPa；輔助氣壓強：69 kPa；碰撞能量：20～50 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜分析結(jié)果

實驗采用Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀進行分析，Dionex Ultra 3000型超高壓液相色譜儀進行雜質(zhì)對照品比對實驗，液相色譜條件根據(jù)國際農(nóng)藥分析協(xié)作委員會發(fā)布的吡唑醚菌酯CIPAC方法調(diào)整得到。吡唑醚菌酯原藥中主要雜質(zhì)的UPLC譜圖示于圖2，采用面積歸一法確定各組分的相對百分含量。由于吡唑醚菌酯在190～290 nm波長范圍內(nèi)均有紫外吸收，本實驗考察了211、254、278 nm 3個波長下雜質(zhì)的分布，將3個含量大于0.1%的雜質(zhì)(A、B、C)作為分析對象，其結(jié)果列于表1。

2.2 質(zhì)譜分析結(jié)果

2.2.1吡唑醚菌酯的質(zhì)譜分析 在正離子模式下，吡唑醚菌酯原藥主要成分的質(zhì)譜圖示于圖3。從同位素峰強度來看，強度最高的m/z388.105 2、410.087 1兩個離子均含有1個氯原子，推測其分別為[M+H]+和[M+Na]+離子，與吡唑醚菌酯正離子的理論分子質(zhì)量(388.105 9 u)相吻合，一級質(zhì)譜的誤差為0.7個原子單位。選擇m/z388.105 2為母離子進行HCD MS/MS測定，觀察到4個主要的碎片離子峰m/z296.058 4、194.081 3、164.070 8、163.062 8，推測其質(zhì)譜裂解途徑示于圖4。

圖2 吡唑醚菌酯原藥中主要雜質(zhì)的UPLC譜圖Fig.2 UPLC spectra of the main impurities in pyraclostrobin

編號No 保留時間tR/min相對百分含量Relativecontent/%211nm254nm278nm吡唑醚菌酯11 299 13999 21299 233雜質(zhì)A10 90 1170 1060 108雜質(zhì)B13 20 1340 1330 137雜質(zhì)C14 60 1730 1320 179

根據(jù)吡唑醚菌酯的相對分子質(zhì)量推斷各碎片離子的可能結(jié)構(gòu)。由于m/z163.062 8是吡唑醚菌酯有效成分二級質(zhì)譜中的碎片峰，因此它所含元素種類只可能有C、H、O、N，從數(shù)學(xué)角度將這4種元素擬合的化學(xué)式按照誤差由小到大排列為：C9H9NO2、C7H7ON4、C6H11O5、C5H5N7、C4H9O4N3等。高分辨質(zhì)譜中，經(jīng)過質(zhì)量軸校準后的誤差一般不會超過0.004個原子單位，因此只有前5個擬合結(jié)果可能性最大。由于吡唑醚菌酯正離子的化學(xué)式為C19H19ClN3O4+，其碎片化學(xué)式中C、H、O、N各元素的個數(shù)不可能超過母離子，所以第2、3、4個化學(xué)式不符合實際情況，而第5個化學(xué)式的不飽和度與吡唑醚菌酯本身含多個芳香環(huán)的結(jié)構(gòu)特點不符。因此，可以確定m/z163.062 8對應(yīng)的化學(xué)式是C9H9NO2+。同理，可依次推斷另外3個碎片離子m/z296.058 4、194.081 3、164.070 8對應(yīng)的化學(xué)式分別為C16H11ClN3O+、C10H12NO3+、C9H10NO2+。

圖3 吡唑醚菌酯原藥主要成分的一級(a)與二級(b)質(zhì)譜圖Fig.3 MS (a) and MS/MS (b) spectra of pyraclostrobin

注：圖中各碎片離子的分子質(zhì)量為理論值圖4 吡唑醚菌酯原藥主要成分可能的裂解途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathway of pyraclostrobin

ESI電離源一般是電荷誘導(dǎo)發(fā)生的，通常失去中性分子發(fā)生電子對的轉(zhuǎn)移，能夠觀察到偶電子離子。但對于某些化合物，偶電子離子也會丟失1個中性自由基生成奇電子離子[14]。丁友超等[15]在研究4種染料的ESI MS/MS中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生的特征奇電子離子與偶氮、三苯甲烷、蒽醌和硝基苯這4種發(fā)色團的誘導(dǎo)裂解有關(guān)。這種現(xiàn)象在ESI質(zhì)譜中已有較多的報道，但目前尚缺乏成體系的理論支持。本實驗中的4個碎片離子均含有奇數(shù)個氮原子，一般來說它們的相對分子質(zhì)量應(yīng)為偶數(shù)，而m/z163.062 8離子的相對分子質(zhì)量卻為奇數(shù)，因此推斷其為奇電子離子，是由某個偶電子離子失去1個自由基得到的。m/z194.081 3與m/z163.062 8相差31.018 5 u，是1個甲氧基自由基的相對分子質(zhì)量。因此，推測m/z163.062 8是由m/z194.081 3在高能碰撞誘導(dǎo)下裂解失去1個甲氧基自由基后發(fā)生電子重排得到的。

圖5 雜質(zhì)A的一級(a)與二級(b)質(zhì)譜圖Fig.5 MS (a) and MS/MS (b) spectra of impurity A

2.2.2雜質(zhì)A的質(zhì)譜分析 雜質(zhì)A在正離子模式下的一級質(zhì)譜圖示于圖5a，圖中可以觀察到m/z358.094 6、380.076 6離子信號，分別為[M+H]+和[M+Na]+離子，其中，m/z358.094 6比吡唑醚菌酯正離子少了30.010 0 u，恰好是1個甲醛(30.010 6 u)的分子質(zhì)量。選擇m/z358.094 6為母離子進行二級質(zhì)譜(碰撞能量20 eV)測定，觀察到3個主要的碎片離子峰m/z326.069 1、164.070 6、132.044 5，示于圖5b。雜質(zhì)A與吡唑醚菌酯有著共同的碎片離子m/z164.070 6，但沒有m/z194.081 3碎片，說明雜質(zhì)A與主成分的氨基甲酸酯部分可能相同，但又缺失了氨基上的甲氧基。因此，推測雜質(zhì)A可能的裂解途徑示于圖6。雜質(zhì)A的裂解途徑有2種可能：一種是先失去1分子甲醇后得到m/z326.069 1的中間過渡態(tài)，經(jīng)過電子重排后得到更穩(wěn)定的共軛結(jié)構(gòu)；另一種是直接失去1分子對氯吡唑醇，得到與吡唑醚菌酯相同的碎片離子m/z164.070 6。

2.2.3雜質(zhì)B的質(zhì)譜分析 雜質(zhì)B在正離子模式下的質(zhì)譜圖示于圖7，圖7a中m/z436.082 0、458.063 8離子信號分別為[M+H]+和[M+Na]+離子。選擇m/z436.082 0為母離子進行MS/MS測定(碰撞能量20 eV)，產(chǎn)生4個主要的碎片離子峰m/z296.058 5、 242.057 9、212.047 3、163.062 9，同時還有m/z356.077 2、63.000 3等強度相對較弱的特征碎片峰，示于圖7b。通過雜質(zhì)B分子離子峰的同位素比，發(fā)現(xiàn)其含有2個氯原子，比吡唑醚菌酯分子質(zhì)量多47.977 1 u，即1個氯甲烷的分子質(zhì)量；二級質(zhì)譜圖中觀察到的m/z63.000 1碎片峰與氯乙烷ClCH2CH2+碎片的精確理論分子質(zhì)量相吻合。這是因為在合成吡唑醚菌酯反應(yīng)過程中使用了二氯乙烷為反應(yīng)溶劑?；谝陨闲畔ⅲ茰y雜質(zhì)B的結(jié)構(gòu)可能是氯乙基取代了吡唑醚菌酯的1個甲基。通過二級質(zhì)譜圖中的m/z356.077 2、296.058 5碎片峰，推測雜質(zhì)B與吡唑醚菌酯分子的氨基甲酸酯部分可能相同，其可能的裂解途徑示于圖8。其中，碎片離子m/z163.062 8是由m/z242.057 9失去1個氯乙氧基自由基后重排得到的奇電子離子，該雜質(zhì)可能是羥胺中間體與二氯乙烷溶劑在堿性環(huán)境下發(fā)生取代反應(yīng)脫去1分子氯化氫的產(chǎn)物。

2.2.4雜質(zhì)C的質(zhì)譜分析 雜質(zhì)C在正離子模式下的質(zhì)譜圖示于圖9，圖9a中m/z466.015 9、487.997 8離子信號分別為[M+H]+和[M+Na]+離子。選擇m/z466.015 9為母離子進行MS/MS測定(碰撞能量20 eV)，產(chǎn)生了4個主要的碎片離子m/z355.071 7、194.081 3、164.070 6、163.062 8，示于圖9b。從圖9a可以看出，雜質(zhì)C分子結(jié)構(gòu)中含有多個鹵原子，比吡唑醚菌酯的分子質(zhì)量多77.911 2 u，即1個Br的原子質(zhì)量。因此，推測雜質(zhì)C的結(jié)構(gòu)可能為吡唑醚菌酯的1個H原子被Br原子取代。

圖6 雜質(zhì)A可能的裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathway of impurity A

圖7 雜質(zhì)B的一級(a)與二級(b)質(zhì)譜圖Fig.7 MS (a) and MS/MS (b) spectra of impurity B

從合成路線分析Br原子的位置，有2種可能性，示于圖10。一種可能性是芐基溴化的步驟中發(fā)生了二溴化副反應(yīng)，芐基上有2個H原子被Br原子取代，繼續(xù)反應(yīng)，其中1個Br原子被1-(4-氯苯基)-1H-3-吡唑醇取代，而另1個Br原子則保留在芐基上，這種解釋更符合合成理論的預(yù)期；另一種可能性是Br原子取代了吡唑環(huán)上的4號位H，其來源是芐溴化反應(yīng)中過量的Br被帶入到了下一步反應(yīng)，直接與吡唑醚菌酯發(fā)生了溴化反應(yīng)。

進一步分析雜質(zhì)C的二級質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)其含有與吡唑醚菌酯相同的主要碎片離子m/z194.081 3、164.070 6，說明雜質(zhì)C與吡唑醚菌酯分子的甲氧基氨基甲酸酯部分可能是相同的，m/z194.081 3碎片是雜質(zhì)C失去1分子溴代1-(4-氯苯基)-1H-3-吡唑醇得到的，由此推測Br原子可能位于吡唑醇片段上。綜合質(zhì)譜和合成路線分析的結(jié)果，雜質(zhì)C的結(jié)構(gòu)可能是吡唑醚菌酯吡唑環(huán)被溴化的產(chǎn)物(圖10中可能性2)，由此進一步推測雜質(zhì)C可能的裂解途徑，示于圖11。其中，m/z355.070 6是一個奇電子離子。

圖8 雜質(zhì)B可能的裂解途徑Fig.8 Proposed fragmentation pathway of impurity B

圖9 雜質(zhì)C的一級(a)與二級(b)質(zhì)譜圖Fig.9 MS (a) and MS/MS (b) spectra of impurity C

2.3 雜質(zhì)對照品的比對與確認

根據(jù)以上由質(zhì)譜和合成路線推測的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，經(jīng)過實驗室合成得到雜質(zhì)對照品，將對照品的保留時間、質(zhì)譜信息與原藥中的雜質(zhì)對比，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，合成的雜質(zhì)對照品與原藥中雜質(zhì)的保留時間、質(zhì)譜圖一致，說明質(zhì)譜分析結(jié)果準確可靠。

3 結(jié)論

本工作應(yīng)用UPLC-MS和HCD MS/MS技術(shù)分析了實驗室合成的吡唑醚菌酯原藥中3個主要雜質(zhì)。結(jié)果表明，在吡唑醚菌酯以及雜質(zhì)B、C的HCD質(zhì)譜中，同時存在著偶電子離子和奇電子離子。結(jié)合原藥合成路線推測出3個雜質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)：雜質(zhì)A產(chǎn)生于硝基羥胺化還原步驟中；雜質(zhì)B由羥胺中間體與二氯乙烷溶劑反應(yīng)產(chǎn)生；雜質(zhì)C是芐溴化反應(yīng)步驟中過量的溴導(dǎo)致的。由此可見，在吡唑醚菌酯原藥的工藝改進活動中，控制羥胺化、溴化兩個步驟中的副反應(yīng)，有助于提升原藥的質(zhì)量。

圖10 雜質(zhì)C生成的2種途徑Fig.10 Two possible formation pathways of impurity C

圖11 雜質(zhì)C可能的裂解途徑Fig.11 Proposed fragmentation pathway of impurity C

保留時間tR/min一級質(zhì)譜MS(m/z)二級質(zhì)譜MS/MS(m/z)原藥中雜質(zhì)A10 65358 0946326 0691，164 0706，132 0445雜質(zhì)A對照品10 67358 0941326 0690，164 0706，132 0445原藥中雜質(zhì)B12 80436 0820296 0585，242 0579，212 0473，163 0629雜質(zhì)B對照品12 88436 0812296 0587，242 0576，212 0471，163 0627原藥中雜質(zhì)C14 26466 0159355 0717，194 0813，164 0706，163 0628雜質(zhì)C對照品14 31466 0152355 0708，194 0808，164 0702，163 0624

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