任欣怡，朱 晰，張代超，陳 探，程遠(yuǎn)國，趙小平，車津晶

（1.上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

生物技術(shù)藥物具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大及異源性等特點(diǎn)，與小分子類藥物不同的是其擁有較強(qiáng)的免疫原性。免疫原性的產(chǎn)生往往伴隨藥物濃度的降低，藥物療效的減弱或是不良反應(yīng)的產(chǎn)生。因此，對(duì)生物技術(shù)藥物免疫原性進(jìn)行檢測(cè)具有重要的意義［1-4]。目前，國內(nèi)免疫原性的檢測(cè)尚缺乏相關(guān)的技術(shù)指導(dǎo)原則，而美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥物管理局的相關(guān)指導(dǎo)原則側(cè)重于臨床免疫原性的評(píng)價(jià)［5-7]。

免疫原性分析檢測(cè)的抗藥抗體在體內(nèi)多以混合物形式存在，無法獲得代表待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)品，因此免疫原性的檢測(cè)和評(píng)價(jià)具有半定量的特點(diǎn)。這個(gè)特點(diǎn)是其在檢測(cè)以及方法建立的過程中與其他常見的生物分析方法的不同之處。免疫原性分析常用的檢測(cè)方法和技術(shù)有夾心酶聯(lián)免疫吸附法（>enzyme>linked immunosorbent assay，ELISA ）、橋連ELISA、表面等離子共振技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)和配體結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等［8-9]。由于無法獲得待測(cè)基質(zhì)中真實(shí)抗受試物抗體的標(biāo)準(zhǔn)品，因此在方法建立過程中要通過在基質(zhì)中外加陽性對(duì)照抗體來進(jìn)行待測(cè)樣品的模擬，還需結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，通過合適的自然樣本群基質(zhì)建立待測(cè)樣本的基底信號(hào)值［10-13]。

本文旨在對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)及美國、歐盟的免疫原性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則分析的基礎(chǔ)上對(duì)非臨床免疫原性分析方法的開發(fā)和驗(yàn)證進(jìn)行探討。

1 檢測(cè)步驟

由于無法獲得待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)品，免疫原性檢測(cè)無法進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)，只能通過概率的方法盡可能獲得準(zhǔn)確結(jié)果。免疫原性分析往往采用“多步法”進(jìn)行：①通過一個(gè)具有一定假陽性的方法進(jìn)行樣本的快速篩選，排除大量陰性結(jié)果；②通過一個(gè)更為準(zhǔn)確的方法對(duì)篩選出的“疑似陽性樣本”進(jìn)行確證檢測(cè)，進(jìn)一步排除陰性結(jié)果；③對(duì)得到的陽性樣本進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)和分析，如滴度檢測(cè)和中和抗體檢測(cè)［14]。方法的建立和驗(yàn)證要根據(jù)檢測(cè)的步驟來進(jìn)行選擇和調(diào)整。樣本檢測(cè)如僅需進(jìn)行篩選和確證，則僅需考慮與篩選和確證相關(guān)的指標(biāo)。如需要進(jìn)一步檢測(cè)滴度甚至中和抗體，則方法中要添加與之相關(guān)的指標(biāo)［15]。

2 自然樣本群的選擇

應(yīng)盡可能選擇與待測(cè)樣本相同或相近的自然樣本群，如待檢測(cè)樣本來自老年或患類風(fēng)濕性疾病的個(gè)體，則用于方法建立的自然樣本群應(yīng)選擇與以上狀態(tài)相一致的個(gè)體［16]。用于方法學(xué)建立的自然樣本群對(duì)于待檢樣本應(yīng)具有代表性，代表待檢樣本在自然狀態(tài)下的一般情況。

3 對(duì)照樣本的選擇

對(duì)照樣本是用來考察方法有效性的參照樣本。對(duì)照樣本分為陽性對(duì)照樣本和陰性對(duì)照樣本。陽性對(duì)照樣本往往通過在基質(zhì)中外加陽性對(duì)照抗體來進(jìn)行模擬。陰性對(duì)照樣本則通過混合的自然樣本群樣本來獲得［17]。

3.1 陽性對(duì)照樣本的選擇

由于一般無法準(zhǔn)確獲得待測(cè)藥物在機(jī)體內(nèi)的真實(shí)抗體，因此要通過陽性對(duì)照抗體來作為藥物在體內(nèi)免疫原性情況的陽性對(duì)照。陽性對(duì)照抗體一般要求為多克隆抗體，以此更好反映機(jī)體內(nèi)的真實(shí)情況。一般情況下，生物技術(shù)藥物臨床前藥物代謝及安全性評(píng)價(jià)在靈長類動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行，由于制備猴源的陽性對(duì)照多抗成本較高，因此廣泛應(yīng)用的陽性對(duì)照抗體是兔源或羊源多抗。在多抗制備和純化過程中，為了得到更具代表性和特異性的陽性對(duì)照抗體，多抗血清要經(jīng)過抗原吸附過程，以去除大部分非相關(guān)抗體。為了在長期試驗(yàn)中得到性質(zhì)穩(wěn)定且可重復(fù)的陽性對(duì)照抗體，亦可采用≥2株親和力不同的單克隆抗體進(jìn)行混合。

3.2 陰性對(duì)照樣本的選擇

陰性對(duì)照是為了提供自然樣本群的本底值。由于個(gè)體樣本間或多或少會(huì)存在個(gè)體差異，因此陰性對(duì)照應(yīng)以混合自然個(gè)體制得，以消除個(gè)體間差異，使本底值更加穩(wěn)定并具有代表性。陰性對(duì)照在免疫原性分析時(shí)作為臨界值計(jì)算的依據(jù)。

4 臨界值的計(jì)算

臨界值為通過考察一個(gè)小規(guī)模自然樣本群個(gè)體的信號(hào)值波動(dòng)情況，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)原理計(jì)算得到的在一定百分位數(shù)內(nèi)可代表自然樣本群分布情況的信號(hào)值。通常采用＞9 5%的百分位數(shù)來計(jì)算臨界值。綜合考慮小規(guī)模自然樣本群中離群個(gè)體情況和不同分析批中離群個(gè)體情況來排除離群個(gè)體因?yàn)闃颖咀陨碓蛟斐傻墓潭ǖ碾x群稱為生物離群值（如含天然抗體的個(gè)體），此值反映了小規(guī)模樣本群中個(gè)體信號(hào)的波動(dòng)。因?yàn)榉治雠治鲈蚨斐傻碾S機(jī)離群稱為分析離群值，此值反映了不同分析批中個(gè)體信號(hào)的波動(dòng)。離群值的判斷推薦使。用統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行客觀判斷。臨界值在計(jì)算過程中要先排除各個(gè)分析批中分析離群值，再排除樣本群中生物離群值，然后通過計(jì)算樣本群個(gè)體的均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差來獲得。為消除不同批次間標(biāo)準(zhǔn)偏差之間的變異，樣本群個(gè)體的標(biāo)準(zhǔn)偏差通過各批個(gè)體的標(biāo)準(zhǔn)偏差的幾何平均值來計(jì)算［18-21]。

4.1 篩選臨界值的確定

通過統(tǒng)計(jì)分析自然樣本群個(gè)體檢測(cè)值的變化規(guī)律，得到符合該法的篩選臨界值類型。篩選臨界值分為固定篩選臨界值，浮動(dòng)篩選臨界值以及動(dòng)態(tài)篩選臨界值等。其中較為常見的為前兩者。固定篩選臨界值是指相同的自然樣本群在多個(gè)分析批中經(jīng)統(tǒng)計(jì)得到批間方差齊性，且均值無顯著差異情況下采用的臨界值。待測(cè)樣本檢測(cè)時(shí)的篩選臨界值即為通過方法學(xué)確定的臨界值。在待測(cè)樣本檢測(cè)階段此數(shù)值為固定數(shù)值。高于此數(shù)值的待測(cè)樣本為疑似陽性。浮動(dòng)篩選臨界值是指，相同的自然樣本群在多個(gè)分析批中經(jīng)統(tǒng)計(jì)得到批間方差齊性，但均值有顯著差異的情況下采用的臨界值。由于不同分析批間檢測(cè)數(shù)值均值存在差異，因此在待測(cè)樣本檢測(cè)時(shí)無法采用固定數(shù)值作為臨界值，需結(jié)合陰性對(duì)照進(jìn)行各分析批臨界值的校正，得到隨各分析批數(shù)值上下浮動(dòng)的臨界值。即便在方法學(xué)中證明了自然樣本群個(gè)體批間均值無顯著差異，亦推薦采用浮動(dòng)篩選臨界值以消除不同分析批中潛在的不穩(wěn)定風(fēng)險(xiǎn)，以獲得更為準(zhǔn)確的數(shù)值。

結(jié)合文獻(xiàn)［21]及筆者在實(shí)際操作中的經(jīng)驗(yàn)，在篩選臨界值確定時(shí)首先排除不同批次的離群值。然后檢測(cè)不同批次個(gè)體數(shù)據(jù)的分布，來確定數(shù)據(jù)是否滿足計(jì)算的需求。以偏度系數(shù)及Shapiro-Wilk檢驗(yàn)中P值來評(píng)估數(shù)據(jù)的分布。當(dāng)數(shù)據(jù)分布滿足偏度系數(shù)位于［-1，1]或P＞0.05其中任一個(gè)條件時(shí)，可進(jìn)行下一步計(jì)算；當(dāng)偏度系數(shù)位于［-1，1]之外且P≤0.05時(shí)，該數(shù)據(jù)不可采用，需分析原因后重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。簡要流程見圖1。

4.2 確證臨界值的確定

圖1 篩選臨界值計(jì)算中數(shù)據(jù)處理和判斷流程圖

待測(cè)樣本經(jīng)過篩選實(shí)驗(yàn)后得到的疑似陽性樣本要經(jīng)過再次確證方可得到可信的結(jié)果。由于抗藥抗體的特異性，因此通過在疑似陽性樣本中加入過量藥物分子的方式來進(jìn)行待測(cè)樣本的確定。疑似陽性樣本中若含抗藥抗體，加入過量藥物分子后，其中游離的藥物分子將與檢測(cè)試劑即標(biāo)記了的藥物分子競爭結(jié)合抗藥抗體，從而造成檢測(cè)出的抗藥抗體信號(hào)值下降。通過分析自然樣本群個(gè)體中加入同樣濃度的過量藥物分子后信號(hào)下降的情況可得到自然樣本加入過量藥物分子后非特異的信號(hào)下降比例。結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，在一定百分位數(shù)的置信區(qū)間內(nèi)得到一個(gè)比例數(shù)值，此比例數(shù)值即為待測(cè)樣本確證實(shí)驗(yàn)時(shí)的臨界值，即確證臨界值，通常采用＞99%的百分位數(shù)進(jìn)行計(jì)算［3]。由于此置信區(qū)間較篩選臨界值置信區(qū)間更為寬泛，可有效涵蓋分析批的數(shù)值波動(dòng)，且篩選實(shí)驗(yàn)已去除了大多數(shù)陰性結(jié)果，因此在實(shí)際操作中往往無需再考慮分析批間的波動(dòng)，僅需采用一個(gè)固定的確證臨界值。

5 其他

5.1 精密度檢測(cè)

方法學(xué)驗(yàn)證階段應(yīng)充分考慮待測(cè)樣本檢測(cè)時(shí)的實(shí)際情況，即要分別考量篩選、確證或滴度實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)可靠性。通過對(duì)照樣本的檢測(cè)來進(jìn)行方法可靠性的考察。至少需要考察陰性對(duì)照，低濃度陽性對(duì)照及高濃度陽性對(duì)照樣本的檢測(cè)可靠性。由于免疫原性檢測(cè)半定量的特點(diǎn)，無法對(duì)其計(jì)算回歸濃度，因此檢測(cè)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性用檢測(cè)數(shù)值間的精密度來表示。要同時(shí)考察批內(nèi)和批間（日間）精密度。

5.2 特異性和選擇性檢測(cè)

方法的特異性和選擇性對(duì)于免疫原性分析結(jié)果的解讀非常重要。特異性指的是該法可檢出針對(duì)受試物抗體的能力。其檢測(cè)出的結(jié)果是只與受試物相關(guān)，而不與試劑相關(guān)。選擇性指的是方法在基質(zhì)中檢出抗受試物抗體的能力?；|(zhì)中可能存在潛在的干擾檢測(cè)的物質(zhì)。方法特異性和選擇性不好會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果中假陽性的產(chǎn)生。方法特異性的考察往往通過外加受試物是否可抑制檢測(cè)信號(hào)值來予以證明。選擇性的考察往往通過比較外加在個(gè)體基質(zhì)，混合基質(zhì)及稀釋液中的特定濃度的陽性對(duì)照的信號(hào)值之間的差異來進(jìn)行證明。特異性和選擇性的證明往往會(huì)決定免疫原性分析時(shí)所用到的最小稀釋度。通過樣品的稀釋，可降低基質(zhì)中非相關(guān)物質(zhì)信號(hào)的干擾。但過度的稀釋會(huì)降低樣品檢測(cè)的靈敏度，因此在免疫原性分析中樣品的稀釋多半介于1∶5～1∶100之間。

5.3 靈敏度檢測(cè)

免疫原性分析方法中靈敏度是通過基質(zhì)中檢測(cè)靈敏度和藥物耐受來體現(xiàn)的。檢測(cè)靈敏度通過類似生物分析靈敏度的方法來獲得。簡要說來，通過建立陽性對(duì)照抗體的滴度曲線來進(jìn)行靈敏度的評(píng)價(jià)。將對(duì)應(yīng)分析批的臨界值回代回滴度曲線以求得該分析批所對(duì)應(yīng)的臨界值。由于免疫原性分析檢測(cè)方法固有的特點(diǎn)，各分析批間會(huì)存在信號(hào)的變異，導(dǎo)致各分析批所得的靈敏度數(shù)值也非一成不變，因此最終檢測(cè)靈敏度會(huì)用一個(gè)范圍來表示。藥物耐受是指在某一特定濃度陽性對(duì)照抗體存在情況下可被持續(xù)檢測(cè)為陽性時(shí)最高的受試物濃度。往往不同濃度陽性對(duì)照抗體所能耐受的受試物濃度也不同，需至少檢測(cè)和評(píng)價(jià)低和高濃度陽性對(duì)照抗體存在情況下的藥物耐受情況。最終檢測(cè)靈敏度和藥物耐受均需換算為基質(zhì)中所對(duì)應(yīng)的陽性對(duì)照抗體或受試物的質(zhì)量濃度，以換算后的質(zhì)量濃度表述方法的靈敏度［22]。

5.4 生物類似藥免疫原性對(duì)比

在進(jìn)行非臨床生物類似藥免疫原性對(duì)比時(shí)，方法的建立要同時(shí)考察并兼顧原研藥和生物類似藥（受試物）。兩者免疫原性的對(duì)比必須是在同一試驗(yàn)體系內(nèi)進(jìn)行。不同試驗(yàn)間的對(duì)比并無意義，有時(shí)甚至是錯(cuò)誤的。在檢測(cè)方法中，可采取2種檢測(cè)策略：分別建立針對(duì)原研藥和受試物的檢測(cè)方法并進(jìn)行驗(yàn)證；僅建立針對(duì)受試物的檢測(cè)方法。建立2種檢測(cè)方法需要在方法學(xué)驗(yàn)證中比較各個(gè)方法指標(biāo)間原研藥和受試物之間的一致性，且在樣本檢測(cè)時(shí)需要進(jìn)行交叉檢測(cè)，工作量大，且無法排除方法間誤差帶來的變異，對(duì)于最終數(shù)據(jù)的解釋帶來了較大的挑戰(zhàn)。因此，目前更推薦的用于生物類似藥評(píng)價(jià)的方法為僅建立針對(duì)受試物的檢測(cè)方法。通過在靈敏度考察時(shí)對(duì)比方法對(duì)于原研藥和受試物的藥物耐受來考察原研藥和受試物之間的一致性，在樣本檢測(cè)時(shí)用該法進(jìn)行檢測(cè)，最終數(shù)據(jù)便于比較和解釋，但此法也存在著一些局限，即僅能檢出針對(duì)受試物的抗體，而不能檢出原研藥特有的受試物不具備的抗體［10-12]。

6 總結(jié)與展望

在非臨床藥物評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，免疫原性扮演著解釋藥代，毒代和藥效數(shù)據(jù)的作用。在生物類似藥的評(píng)價(jià)中免疫原性在判斷一致性時(shí)起到重要的作用，但生物類似藥的一致性的最終判斷要結(jié)合藥代數(shù)據(jù)，毒理數(shù)據(jù)及藥效數(shù)據(jù)綜合判斷。通過將免疫原性的數(shù)據(jù)和藥代、毒代數(shù)據(jù)的綜合，可有效地解釋藥物在體內(nèi)的去向，并對(duì)藥物暴露量的異常變化提供解釋的依據(jù)。通過將免疫原性的數(shù)據(jù)與藥效數(shù)據(jù)的綜合，可通過中和抗體的數(shù)據(jù)解釋藥效中的異常降低。目前，國內(nèi)大部分企業(yè)在進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià)時(shí)，由于考慮到試驗(yàn)周期及申報(bào)時(shí)限的要求，往往會(huì)同步開展藥物濃度分析及免疫原性評(píng)價(jià)試驗(yàn)。對(duì)于免疫原性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的解釋和應(yīng)用還存在諸多的不足，更多地停留在按指導(dǎo)原則執(zhí)行的層面上，而缺少對(duì)數(shù)據(jù)解讀的能力。無法將免疫原性數(shù)據(jù)與藥代，毒理及藥效數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。從而損失了很多數(shù)據(jù)的價(jià)值。但通過國內(nèi)同行的不斷努力及國內(nèi)醫(yī)藥企業(yè)的發(fā)展，相信國內(nèi)的藥物評(píng)價(jià)水平在不遠(yuǎn)的將來會(huì)有長足的進(jìn)步。