舒洋 陳實(shí)

江漢大學(xué)附屬醫(yī)院武漢市第六醫(yī)院骨外科（武漢430015）

骨肉瘤（osteosarcoma）是骨科常見的惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，其發(fā)病率占惡性骨腫瘤總數(shù)的20%，占兒童腫瘤總數(shù)的5%。骨肉瘤惡性程度高，早期即可發(fā)生廣泛的肺轉(zhuǎn)移，其預(yù)后差、生存率低。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，骨肉瘤的早期診斷率、切除率、5年生存率都得到了一定的提高。但骨肉瘤初起病癥狀易被忽視，進(jìn)展迅速，患者發(fā)現(xiàn)時(shí)晚期較多且生存率較低、預(yù)后差。術(shù)后并發(fā)癥較多且嚴(yán)重，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移很快，這使得骨肉瘤的總體治療效果還不理想。目前腫瘤最主要的治療手段主要是手術(shù)切除和放、化療，傳統(tǒng)化療藥物雖然能夠在短時(shí)間內(nèi)快速地抑制腫瘤增生和轉(zhuǎn)移，有效地控制晚期惡性腫瘤，但會(huì)給患者帶來嚴(yán)重的毒副作用，這類藥物對患者健康細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷。因此，尋找一種低毒高效的化療替代物是腫瘤治療的一個(gè)主要研究方向，也是目前治療腫瘤的發(fā)展趨勢。

白藜蘆醇（resveratrol）其分子式為C14H12O3，是一種非黃酮類多酚化合物，是從自然界廣泛存在的葡萄、虎杖、花生等植物中提取的一種酚類成分［1-3］。目前已有研究證明白藜蘆醇具有良好的抑制肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、胃癌等細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡的作用［4］。國外有學(xué)者［5］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對骨肉瘤有效，但其機(jī)制尚不明。本實(shí)驗(yàn)通過使用不同濃度的白藜蘆醇干預(yù)骨肉瘤MG?63細(xì)胞，探討白藜蘆醇誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，研究白藜蘆醇對骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的影響，驗(yàn)證白藜蘆醇對人體細(xì)胞毒性作用，將為臨床治療骨肉瘤提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人骨肉瘤細(xì)胞株MG?63購于上海拜力生物公司。白藜蘆醇購自于美國Sigma公司，分別與培養(yǎng)基及DMSO 稀釋為5、10、25、50、100、150 μmol/L用于本實(shí)驗(yàn)。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Trysin）、青霉素和鏈霉素（杭州吉諾公司），胎牛血清（GIBCO公司），兔抗人Caspase?3抗體、兔抗人Caspase?9抗體、兔抗人BAK抗體、兔抗人BAX抗體、兔抗人p53抗體、兔抗人Caspase?8抗體、兔抗人PARP抗體、兔抗人p21抗體、山羊抗兔β?actin二抗（美國cell signaling），磷酸鹽緩沖液（美國Thermo公司），甘氨酸、SDS、Tris堿（美國MBCHEM公司），丙烯酰胺（美國Biomol公司），TEMED、過硫酸銨、麗春紅S（美國Amresco公司），BCA蛋白定量試劑盒、預(yù)染蛋白Marker、ECL（大連寶生物公司），Tween 20（上海華舜生物工程有限公司），RIPA裂解液、PMSF（碧云天生物公司），Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板、Matrigel膠（美國BD公司），凱基Annexin V?FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、凱基細(xì)胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物公司），Roche TUNEL試劑盒（上海麥約爾生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理實(shí)驗(yàn)分為7組，分別為對照組（正常人體細(xì)胞）、5 μmol/L白藜蘆醇組、10 μmol/L 白藜蘆醇組、25 μmol/L 白藜蘆醇組、50 μmol/L 白藜蘆醇組、100 μmol/L 白藜蘆醇組、150 μmol/L白藜蘆醇組。5 μmol/L白藜蘆醇組中加入含有1%血清和5 μmol/L白藜蘆醇的DMEM；10 μmol/L白藜蘆醇組中加入含有1%血清和10 μmol/L白藜蘆醇的DMEM；25 μmol/L白藜蘆醇組中加入含有1%血清和25 μmol/L白藜蘆醇的DMEM；50 μmol/L白藜蘆醇組中加入含有1%血清和50 μmol/L 白藜蘆醇的DMEM；100 μmol/L 白藜蘆醇組中加入含有1%血清和100 μmol/L白藜蘆醇的DMEM；150 μmol/L白藜蘆醇組中加入含有1%血清和150 μmol/L白藜蘆醇的DMEM。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測使用MG?63細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整懸液濃度，96孔板每孔加入100 μL，放入5%CO2，37℃溫箱，待細(xì)胞貼壁，加入相應(yīng)濃度的白藜蘆醇，每孔100 μL，設(shè)4個(gè)復(fù)孔。同等條件的溫箱孵育24 h，顯微鏡觀察。再均加入0.5%MTT 20 μL溶液，溫箱孵育4 h，然后用PBS洗3次，加入含MTT的培養(yǎng)液。之后去除孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入二甲基亞砜150 μL使其充分溶解10 min后測量吸光度值。

1.2.3 Annexin V法檢測細(xì)胞凋亡6孔板中使細(xì)胞密度為1×105/孔，孵育24 h，換液，加入不同濃度的白藜蘆醇。孵育24、48 h后，分別收集MG?63細(xì)胞至離心管中，PBS洗滌后離心。倒去上層液體加入PBS均勻混合后，使用凋亡試劑盒，加入1× Binding Buffer使細(xì)胞1× 106/mL，取100 μL加入 EP 管中，再加入 5 μL FiTcAnnexin 以及 10 μL PI，室溫下避光15 min，最后加入400 μL 1 × Binding Buffer。流式分析儀檢測不同濃度細(xì)胞的凋亡。

1.2.4 羅氏凋亡試劑盒檢測MG?63細(xì)胞凋亡不同濃度的白藜蘆醇處理96孔板中的腫瘤細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，PBS洗滌，分別加入免疫染色固定液100 μL保存。使用羅氏TUNEL試劑盒，加入相應(yīng)染色劑染色，混勻。吸出后加入DAPI 50 μL，10 min，PBS洗滌3次?？篃晒獯銣缭噭┤軇?20 μL封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)MG?63細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)：各條件培養(yǎng)48 h之后，裂解MG?63細(xì)胞提取蛋白，用Western blot分析，加入各種抗體，利用SDS?PAGE電泳，免疫印跡用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影、定洗片。結(jié)果用凝膠成像軟件量掃描條帶灰度。采用IPP6.0以圖像分析軟件檢測。以β?actin作為內(nèi)參，以灰度比值表作為內(nèi)參，表示所檢測蛋白質(zhì)的相對含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布、方差齊性，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），兩組間比較采用SNK檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇處理人骨腫瘤細(xì)胞MG?63的抑制率隨著濃度的增加，腫瘤細(xì)胞明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 白藜蘆醇處理骨腫瘤細(xì)胞MG?63不同時(shí)間段各濃度間的抑制率Tab.1 The inhibition rate of resveratrol treatment of bone tumor cells at different concentrations at different time periods of MG?63 x ± s，%

2.2 白藜蘆醇能導(dǎo)致骨腫瘤細(xì)胞MG?63的凋亡

圖1 MTT檢測不同濃度的白藜蘆醇對MG?63細(xì)胞抑制率Fig.1 MTT assay the inhibition rate of resveratrol in different concentrations on MG?63 cells

2.2.1 流式細(xì)胞儀檢測MG?63細(xì)胞的凋亡MG?63細(xì)胞加入不同濃度的白藜蘆醇處理24 h后，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能使MG?63細(xì)胞凋亡，不同濃度作用下的MG?63細(xì)胞凋亡數(shù)遞增，分別為（6.10±1.06）%、（11.10 ± 1.22）%、（18.10 ± 1.98）%；MG?63細(xì)胞加入不同濃度的白藜蘆醇處理48 h后，細(xì)胞凋亡數(shù)遞增為（14.96±1.59）%、（46.97±1.68）%、（65.02±4.59）%。不同濃度的白藜蘆醇處理MG?63細(xì)胞后呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.05）。而不同濃度白藜蘆醇作用48 h的對照組，正常細(xì)胞凋亡數(shù)沒有增加，有下降趨勢。見圖2。

圖2 Annexin V法檢測細(xì)胞凋亡Fig.2 Annexin V method was used to detect apoptosis

2.2.2 羅氏凋亡試劑盒檢測MG?63細(xì)胞的凋亡用不同濃度的白藜蘆醇（0、50、100 μmol/L）加入人骨肉瘤細(xì)胞MG?63孵育，24 h后MG?63細(xì)胞的凋亡率分別為（1.15 ± 0.09）%、（0.06 ± 0.02）%、（8.10 ± 0.66）%；48 h后MG?63細(xì)胞的凋亡率分別為（0.04±0.03）%、（21.47±1.98）%、（39.23±1.45）%，不同濃度的白藜蘆醇處理后，差異有顯著性（P＜0.05）。對照組用≥50 μmol/L白藜蘆醇處理后，正常細(xì)胞未出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。隨著濃度的增加，人骨肉瘤細(xì)胞MG?63凋亡細(xì)胞增加，而對照組幾乎無任何凋亡現(xiàn)象。見圖3。

圖3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡Fig.3 TUNEL assay for cell apoptosis

2.3 Western blot法測MG?63細(xì)胞中各蛋白表達(dá)用不同濃度的白藜蘆醇（0、50、100 μmol/L）處理MG?63細(xì)胞，檢測出Bax、Bak、p53蛋白表達(dá)隨著給藥濃度的增加灰度值遞增，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Caspase?3副條帶蛋白值為19 kD的灰度值隨著給藥濃度增加也出現(xiàn)遞增趨勢（P＜0.05）。對照組檢測的Bax、Bak、p53、Caspase?3、Cas?pase?9蛋白的表達(dá)均沒有明顯改變。見圖4。

圖4 白藜蘆醇誘導(dǎo)骨腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 OS induces the expression of apoptosis related proteins in bone tumor cells

3 討論

白藜蘆醇是一種多酚類物質(zhì)，具有多重生物學(xué)效性。因證實(shí)紅酒中有心腦血管保護(hù)作用的一種重要有效成分而廣受關(guān)注。后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇不僅有心血管保護(hù)作用，還能抑制腫瘤細(xì)胞的生長［6］。本研究中白藜蘆醇能上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，抑制Bcl?2蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致骨腫瘤細(xì)胞的抑制和凋亡等，證實(shí)了白藜蘆醇能在一定程度上對骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生作用。有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇也可以通過影響骨肉瘤細(xì)胞中MMP?2的表達(dá)來影響細(xì)胞增殖和遷移，起到抗腫瘤的作用［7］。本研究結(jié)果說明白藜蘆醇能不同程度的抑制骨腫瘤MG?63細(xì)胞，對照組幾乎沒有影響，Caspase?3（p19）的表達(dá)增加，從而導(dǎo)致骨腫瘤細(xì)胞的凋亡。p53基因是1979年發(fā)現(xiàn)分子量為53 kD的尿蛋白［8-9］，該蛋白在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量增高［10］，p53基因是目前世界上研究最多最熱門的一個(gè)基因，它是一種抑癌基因，與細(xì)胞的生長、分化、死亡有重要的關(guān)系及聯(lián)系，近年來研究表明其與細(xì)胞的凋亡有關(guān)［11］，p53在BCL?2蛋白家族依賴的細(xì)胞調(diào)控中有重要作用，p53可通過下調(diào)BCL?2的表達(dá)使BAX激活，進(jìn)而影響細(xì)胞的凋亡［12］。細(xì)胞的凋亡途徑主要有內(nèi)在、外在及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基信號(hào)途徑。p53能通過凋亡途徑導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡［13-14］，NAKAGAWA等［15］發(fā)現(xiàn)Caspase?12 存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子動(dòng)態(tài)平衡破壞或過多蛋白積聚于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)可激活 Caspase?12，激活的Caspase?12可進(jìn)一步剪切Caspase?3導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，也發(fā)現(xiàn)p53不僅對線粒體通路而且對死亡受體通路均可導(dǎo)致凋亡的發(fā)生，具有轉(zhuǎn)錄和活化Bax、Bak的能力，通過線粒體凋亡通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路起到調(diào)控作用［16-17］。也有研究發(fā)現(xiàn)p53可激活Bax、Bak的活化，配合線粒體上細(xì)胞色素c和Smac/diablo蛋白的釋放，導(dǎo)致凋亡因子Caspase?9和Caspase?3的活化導(dǎo)致凋亡，也可以直接激活cleaved Caspase?3（p19）［18-19］而導(dǎo)致凋亡。本研究的結(jié)論：白藜蘆醇能使p53蛋白上調(diào)，激活Bax和 Bak，并抑制 Bcl?2蛋白，激活Caspase?3發(fā)生剪切作用，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)論是發(fā)現(xiàn)Caspase?3（p19）的激活直接導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，可能并未通過經(jīng)典的凋亡通路導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。并且白藜蘆醇對人體無害，抑制率還有下降表現(xiàn)，可能對人體有保護(hù)作用，需進(jìn)一步研究。

如今我們治療骨肉瘤仍然采取傳統(tǒng)的手術(shù)以及術(shù)后的化療，手術(shù)給我們的身心帶來創(chuàng)傷，而術(shù)后的化療會(huì)出現(xiàn)不同的毒副反應(yīng)，導(dǎo)致患者生存質(zhì)量的下降，甚至不能耐藥被迫中止治療。此時(shí)若有一種低毒高效的植物提取物取代傳統(tǒng)的化療藥物將是患者的福音，也是醫(yī)療治療上的一個(gè)里程碑。目前白藜蘆醇的研究還在初步階段，但是已經(jīng)初步證實(shí)了白藜蘆醇具有抗腫瘤的作用，白藜蘆醇來源廣泛，開發(fā)利用簡單，深入研究其抗腫瘤機(jī)制對臨床腫瘤患者的治療上具有更現(xiàn)實(shí)的意義。

［1］郭征.我國骨肉瘤治療的現(xiàn)狀與問題及發(fā)展方向［J］.中國骨與關(guān)節(jié)雜志，2015（5）：338?342.

［2］GUSEVA D A，KHUDOKLINAOVA Y Y，MEDVEVEVA N V，et al.Influence of resveratrol and dihydroquercetin inclusion in?to phospholipid nanop?atricles on their bioavailability and spe?cific activity［J］.Biomed Khim，2015，61（5）：598?605.

［3］PAFFETT M L，LUCAS S N，CAMPEN M J.Resveratrol revers?es monocrotaline?induced pulmonary vascular and cardiac dys?function：a potential role for atrogin?1 in smooth muscle［J］.Vascul Pharmacol，2012，56（1?2）：64?73.

［4］CAI H，SCOTT E，KHOLGHI A，et al.Cancer chemopreven?tion：Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in hu?mans and mice［J］.Sci Transl Med，2015，7（298）：298ra117.

［5］ALKHALAF M，JAFFAL S.Potent antiproliferative effects of resveratrol on human osteosarcoma SJSA1 cells：Novel cellular mechanisms involving the ERKs/p53 cascade［J］.Free Radic Biol Med，2006，41（2）：318?325.

［6］ANDREADI C，BRITTON R G，PATEL K R，et al.Resveratrol?sulfates provide an intracellular reservoir for generation of par?ent resveratrol，which induces autophagy in cancer cells［J］.Au?tophagy，2014，10（3）：524?525.

［7］陳健，鄭洋.白藜蘆醇抑制骨肉瘤細(xì)胞系MG?63細(xì)胞增殖和遷移及其機(jī)制研究［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，16（1）：34?38.

［8］LANE D P，CRAWFORD L V.T antigen is bound to a host pro?tein in SV40?transformed cells［J］.Nature，1979，278（5701）：261?263.

［9］ROTTER V，WITTE O N，COFFMAN R，et al.Abelson mu?rine leukemia virus?induced tumors elicit antibodies against a host cell protein，P50［J］.J Virol，1980，36（2）：547?555.

［10］LINZER D I，LEVINE A J.Characterization of a 54K dalton cellular SV40 tumor antigen present in SV40?transformed cells and uninfected embryonal carcinoma cells［J］.Cell，1979，17（1）：43?52.

［11］WAWRYK G E，CHYLINSKA W P，LIS S M，et al.P53 pro?tein in proliferation，repair and apoptosis of cells［J］.Protoplas?ma，2013，251（3）：525?533.

［12］POLYAK K，XIA Y，ZWEIER J L，et al.A model for p53?in?duced apoptosis［J］.Nature，1997，389（6648）：300?305.

［13］MU R，LU N，WANG J，et al.An oxidative analogue of gam?bogic acid?induced apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 is involved in its anticancer activity in vitro［J］.Eur J Cancer Prev，2010，19（1）：61?67.

［14］ALENZI F Q，ALENAZI B Q，AL?ANAZY F H，et al.The role of Caspase activation and mitochondrial depolarisation in cultured human apoptotic eosinophils［J］.Saudi J Biol Sci，2010，17（1）：29?36.

［15］NAKAGAWA T，ZHU H，MORISHIMA N ，et al.Caspase?12 mediates endoplasmic?reticulum?specific apoptosis and cytotox?icity by amyloid?beta［J］.Nature，2000，403（6765）：98?103.

［16］ODA E，OHKI R，MURASAWA H，et al.Noxa，a BH3?only member of the Bcl?2 family and candidate mediator of p53?in?duced apoptosis［J］.Science，2000，288（5468）：1053?1058.

［17］BURNS T F，BERNHARD E J，EL?DEIRY W S.Ti ssue spe?cific expression of p53 target genes suggests a key role f or KILLER/DR5 in p53?dependent apoptosis in vivo［J］.Onco?gene，2001，20（34）：4601?4612.

［18］DEGENHARDT K，CHEN G，LINDSTEN T.BAX and BAK mediate p53?independent suppression of tumorigenesis［J］.Can?cer cell 2002，2（3）：193?203.

［19］HENRY H，THOMAS A，SHEN Y.Regulation of the mitochon?drial checkpoint in P53?mediated apoptosis confers resistance to cell death［J］.Oncogene，2002，21（5）：748?760.