張奇波，皮文輝*

（1.克拉瑪依綠成農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，新疆 克拉瑪依 834000；2.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所）

L-谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是生物合成核酸的必須前體物質(zhì)，是蛋白質(zhì)合成與分解的調(diào)節(jié)物，是體內(nèi)外早起胚胎發(fā)育的必須氨基酸[1-8]。Gln在哺乳動物雌性生殖道子宮液中呈現(xiàn)較高生理濃度[1-4]。Gln添加改善了哺乳動物小鼠、人、豬和牛的胚胎體外發(fā)育率[5-8]。

胚胎體外培養(yǎng)37℃環(huán)境中，氨基酸的代謝和氨基酸自然分解會釋放銨離子 （ammonium，NH4+）進(jìn)入胚胎的周圍環(huán)境中[9]。小鼠和家畜早起胚胎體外培養(yǎng)研究顯示，由于銨的存在，胚胎的生理、發(fā)育和生存能力受到損害[9-12]，甚至影響出生個體健康狀態(tài)[9]。降低培養(yǎng)液氨基酸濃度或改變氨基酸形式，降低銨的蓄積，有利于改善胚胎發(fā)育環(huán)境[9，13]。

哺乳動物胚胎體外培養(yǎng)液添加Gln濃度一般是1 mmol/L或2 mmol/L。然而Gln化學(xué)穩(wěn)定性差，會自然降解成銨和5-吡咯烷酮-2-羧酸 （5-pyrrolidone-2-carboxylic acid）[14]。用含 Gln 的二肽代替培養(yǎng)液中的Gln，能夠避免Gln自然分解產(chǎn)生的銨，降低培養(yǎng)液中銨的累積程度[9]。商品化的人用移植前胚胎培養(yǎng)液已經(jīng)采用Gly-Gln （glycyl-L-glutamine）或 Ala-Gln（Alanyl-L-Glutamine）二肽代替 Gln[15]。Gln 二肽改善了小鼠[9，16，17]、豬[18-19]早期胚胎體外發(fā)育能力。

在含氨基酸的培養(yǎng)液中，綿羊囊胚培養(yǎng)產(chǎn)銨量顯著高于小鼠囊胚，間接表明反芻動物胚胎比嚙齒類胚胎需要代謝利用更多的氨基酸[20]。利用二肽代替Gln，降低培養(yǎng)液中銨的累積量，可能對綿羊胚胎體外培養(yǎng)產(chǎn)生積極影響。

1 材料和方法

1.1 卵母細(xì)胞體外成熟

將屠宰場獲得的綿羊卵巢放在裝有生理鹽水的保溫瓶中，2～4 h帶回實驗室。剪去卵巢周圍多余組織，用生理鹽水清洗2遍，帶入無菌間進(jìn)行采卵。鑷子夾取卵巢置于采卵液 （M199+0.1%BSA+0.1 mg/mL肝素+0.1 mg/mL慶大霉素）中，用無菌手術(shù)刀片將卵泡切開。卵巢切割完成后，用手拉玻璃細(xì)管在體式顯微鏡下選取形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行成熟。1 mL成熟液中 （M199+15%FBS+0.1 IU/mL FSH+0.2 IU/mL LH+1.0 μg/mL雌二醇）培養(yǎng)80枚/mL，培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO2、飽和濕度，成熟培養(yǎng)24 h。

1.2 卵母細(xì)胞體外受精

Percoll梯度離心法處理綿羊精液：從液氮罐中取出綿羊細(xì)管冷凍精液，放入39℃水浴解凍。用HSOF液配制90%和45%的Percoll梯度溶液，將解凍后的冷凍精液輕輕加在Percoll梯度液的表面，進(jìn)行密度梯度離心（500 g 或 2 000 r/min，20 min）。沉淀精子再用5 mL HSOF（SOF+20 mmol/LHEPES+5 mmol/LNaHCO3+0.3%BSA）離心洗滌 （300 g或1 200 r/min，5 min）1次，去上清液后，用受精液將精子密度稀釋至5×106個/mL用于體外受精。

受精前1～2 h在培養(yǎng)皿做好受精液小滴，每滴70 μL，覆蓋石蠟油，放入 CO2培養(yǎng)箱中平衡。SOF液是受精基礎(chǔ)液，添加2%（v/v）發(fā)情羊血清、2.9 mM乳酸鈣和16 μM異丙（去甲）腎上腺素[21]。在精子處理的同時，用200 μL移液器在原成熟盤中反復(fù)吹打培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞復(fù)合體，使卵子間相互分離，去除部分顆粒細(xì)胞。卵子在HSOF中洗滌3次，受精液中洗滌1次。將30～50個卵母細(xì)胞移入受精液滴中，再用移液器吸取10 μL處理后的精液，加入受精液滴中，精子的最終濃度是5×106個/mL。然后將培養(yǎng)皿放入38.5℃、5%CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

1.3 體外發(fā)育培養(yǎng)

發(fā)育液是NaHCO3緩沖的SOF溶液，添加1%（V ∶V）非必須氨基酸溶液（Sigma，M7145）、2%（V ∶V）必須氨基酸溶液（Sigma，B6766）、8 mg/mL BSA（Sigma，A3311）。對照組添加 Gln 2 mmol/L，實驗組添加 Ala-Gln 二肽 （Gibco，GlutaMAX 100×，35050061）2 mmol/L。受精后的合子用發(fā)育液清洗干凈，100～150枚/0.5 mL發(fā)育培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境是38.5℃、5%CO2飽和濕度。整個發(fā)育培養(yǎng)過程不換液。分別在培養(yǎng)的 24 h、48 h、120 h、144 h和168 h觀察，確定卵裂數(shù)、囊胚數(shù)和孵化囊胚數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析

用SPSS軟件統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。胚胎分裂率、囊胚率和孵化囊胚率數(shù)據(jù)利用卡方檢驗進(jìn)行分析，當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 Ala-Gln二肽對綿羊體外受精胚胎發(fā)育的影響

為了分析Ala-Gla二肽對綿羊體外受精胚胎發(fā)育的影響，本實驗進(jìn)行了7次對比實驗。每次實驗當(dāng)天采集新鮮綿羊卵巢，從中收集質(zhì)量好的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，將體外受精后的合子，隨機分為Ala-Gln培養(yǎng)組和Gln培養(yǎng)組進(jìn)行體外發(fā)育培養(yǎng)。每組培養(yǎng)的合子控制在100～150枚。培養(yǎng)24 h、48 h、120 h、144 h 和 168 h，分別觀察卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率。

表1 Ala-Gln或Gln對綿羊體外受精胚胎發(fā)育的影響

統(tǒng)計7次實驗結(jié)果并進(jìn)行卡方檢驗。結(jié)果表明（見表1），受精卵體外培養(yǎng)24 h卵裂率差異不顯著（23.06±3.05 VS 19.80±4.06）。42 h卵裂率（86.17±2.97 VS 82.36±4.52）差異顯著。120 h和144 h的囊胚率差異顯著 （17.66±1.88 VS 13.29±1.67和31.85±1.80 VS 26.37±2.44）。168h孵化囊胚率差異不顯著（16.69±2.12 VS 14.90±1.95）。這些結(jié)果說明，在胚胎培養(yǎng)液中使用Ala-Gln代替Gln，可以有效提高綿羊胚胎在體外的發(fā)育能力。

3 討論

實驗表明，不同物種著床前的胚胎體內(nèi)外發(fā)育能力都受到氨基酸的影響[1-8]。氨基酸已經(jīng)成為早期胚胎發(fā)育培養(yǎng)液中普遍添加的成分。Garden和Lane報道，氨基酸對早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生積極影響的同時，胚胎代謝氨基酸和37℃天然降解氨基酸，導(dǎo)致培養(yǎng)液中蓄積銨離子水平逐漸增加[22]。在添加必需氨基酸和非必須氨基酸，用Ala-Gln代替Gln的培養(yǎng)液中，兩細(xì)胞階段的胚胎，銨離子的積累幾乎可以忽略不計[23]。估計小鼠和牛囊胚代謝產(chǎn)生銨離子的速率分別是 1.0 pmol/胚胎/h和4.3 pmol/胚胎/h[22]。牛囊胚產(chǎn)銨離子速率比小鼠高很多，主要是歸因于代謝水平更高[24]。

Summers[25]等用Gly-L-Gln代替Gln培養(yǎng)小鼠胚胎，沒有影響囊胚率，但刺激了內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增加，可能對胚胎質(zhì)量產(chǎn)生有益影響。Gly-L-Gln或Ala-L-Gln代替Gln的商品化人用胚胎發(fā)育液[15]和豬[18，19]胚胎發(fā)育影響研究，都表明二肽優(yōu)于Gln培養(yǎng)結(jié)果。

本實驗表明，Ala-Gln代替Gln提高了綿羊卵母細(xì)胞體外受精卵裂率、囊胚發(fā)育率（見表1）。由于二肽化學(xué)穩(wěn)定性高，商品化的Ala-Gln試劑為200 mM的液體，配制成2 mM工作濃度時，只需用移液器取適當(dāng)體積溶液，不用稱量。而Gln化學(xué)穩(wěn)定性差，試劑以固體形式保存，每次配制時需要稱量。因此，采用商品化的Ala-Gln溶液，免除了稱量Gln，簡化了綿羊體外受精發(fā)育液配制，改善了胚胎體外發(fā)育能力。

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