張 宣 吳紅彥 李海龍 陳 杰 馬春林

(甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

癡呆是由多種原因導致智力功能障礙的一種臨床綜合征，其中阿爾茨海默病(AD)和血管性癡呆(VD)最為常見，而就目前的臨床就診人群研究結果證明VD高于AD〔1〕。由于臨床確診VD時多為疾病晚期，目前也無特效的治療藥物，近年來學者研究發(fā)現(xiàn)，通過中醫(yī)藥治療可有效改善患者認知功能和行為能力等，并且具有療效滿意、副作用少等眾多優(yōu)勢，合理開發(fā)中醫(yī)藥治療癡呆逐漸受到醫(yī)學研究者的青睞〔2〕。前期臨床研究表明歸芪聰志湯對于改善VD患者癥狀有較好療效，為進一步探討其作用機制，本實驗通過雙側頸動脈結扎法建立VD大鼠模型，觀察歸芪聰志湯對VD大鼠海馬組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導因子(HIF)-1α和血紅素加氧酶(HO)-1表達的影響。

1 資料與方法

1.1動物與分組 SPF級Wistar雌性大鼠，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學院科研實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(甘)2011-0001。造模前經(jīng)過Morris水迷宮測試篩選淘汰不合格大鼠后，留取84只健康大鼠；采用隨機對照法，將大鼠分為假手術組、模型組、歸芪聰志湯高劑量組、歸芪聰志湯中劑量組、歸芪聰志湯低劑量組、陽性對照組，實驗中各組鼠均有缺失。

1.2主要儀器與試劑 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；兔抗VEGF多克隆抗體(批號：AD090110)、兔抗HO-1多克隆抗體(批號：AD082653)、兔抗HIF-1多克隆抗體(批號：AD072912)、兔抗CD34多克隆抗體(批號：140616)，兔SP檢測試劑盒(批號：15121A01)，購自北京博奧森生物技術有限公司；RT-PCR試劑盒(批號：1418J)，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(批號：10274023)，β-actin(批號：AB10KA4661)，由蘭州瑞真生物技術有限公司提供。VEGF正義鏈引物：5′CCAGGATTTAAACCGGGATTTC3′，反義鏈引物：5′TCCTGCAGCATAGCAGATGTGA3′，125 bp；HIF-1α正義鏈引物：5′GCTGTCCACATCAAAGCAGTACTCA3′，反義鏈引物：5′CCAGATTCAAGATCAGCCAGCA3′，100 bp；HO-1正義鏈引物：5′CTTCCAGGGCCGTATAGATATGGTA3′，反義鏈引物：5′AGGTGCACATCCGTGCAGAG3′，120 bp。

1.3藥物 歸芪聰志湯由黃芪30 g、當歸30 g、川芎15 g、石菖蒲15 g、苦參15 g等組成，購自甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院。藥物以總體積的8倍量水冷浸3 h，微沸1 h，煎煮2次后合并濾液制成濃度分別為0.66 g、1.32 g、2.64 g生藥/ml的水提液，無菌條件裝瓶；吡拉西坦膠囊(0.25 g×48片，西安利君方圓制藥有限責任公司)，用生理鹽水配成30 mg/ml的混懸液，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4方法

1.4.1動物模型制作 采用改良后的大鼠雙側頸總動脈永久性結扎法〔3〕。大鼠術前12 h禁食，不禁水，用10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉。大鼠麻醉后，將其仰臥固定在手術臺，頸前部手術區(qū)域去毛，碘酒消毒，頸部正中切開皮膚及皮下組織，取頸前正中切口，鈍性分離皮下結締組織、頸前肌群，仔細分離暴露左側CCA，以“0”號絲線結扎左側CCA的近端及遠端，并從中間剪斷，以徹底阻斷CCA血流，連續(xù)3 d慶大霉素肌肉注射，預防感染，最后逐層縫合皮下結締組織、皮膚。1 w后再結扎右側CCA，操作方法同第1次。假手術組僅分離暴露雙側CCA而不結扎。

1.4.2給藥及取材方法 歸芪聰志湯按高、中、低劑量灌胃給藥，陽性對照組給予吡拉西坦，假手術組、模型組給予等量生理鹽水，劑量1.5 ml/100 g，1次/d，連續(xù)灌胃治療28 d。大鼠麻醉后經(jīng)心臟灌注內(nèi)固定取腦，取大鼠腦最寬部位(海馬冠狀位)約4 mm。

1.4.3動物模型成功的判斷 術后7 d行Morris水迷宮實驗，連續(xù)訓練5 d，每次2 min，第3天開始記錄，取假手術組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，同時計算模型組大鼠平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期的比值，該值>20%定為癡呆鼠〔4〕。

1.4.4大鼠學習記憶能力測試 Morris水迷宮實驗：第1天讓大鼠自由游泳120 s。第2天開始正式對大鼠進行Morris水迷宮測試。將大鼠面向池壁放入水中，每天測試1次，每只每次測試120 s，連續(xù)5 d，記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間(逃避潛伏期)。在測試第6天，撤除水下平臺，讓大鼠在無平臺情況下尋找記憶平臺。隨機選取一入水點，將大鼠面向池壁放入水中，每只大鼠限時游120 s，記錄其在120 s內(nèi)游過原平臺相應位置的次數(shù)。

1.4.5病理組織學檢查 每組隨機抽取6只大鼠的海馬進行石蠟切片，常規(guī)脫蠟、乙醇梯度脫水、蘇木素-伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。應用SP法進行免疫組織化學染色，嚴格按照試劑盒說明進行操作。其中兔抗VEGF、HIF-1α、HO-1的工作濃度分別為1∶100、1∶200、1∶100。光鏡下觀察結果，細胞質、胞核染成棕黃色或棕褐色為陽性細胞。每張片子在400倍下隨機選5個視野，計數(shù)每個視野下的陽性細胞數(shù)目，取平均值，各組免疫組化結果應用Leica Qwin病理圖像分析系統(tǒng)處理。

1.4.6實時熒光定量PCR 將凍存的大鼠海馬組織進行稱重，50～100 mg，加200 μl的Trizol液，研磨充分后再加入剩下的800 μl Trizol液，混勻，室溫放置5 min；4℃，12 000 r/min，離心5 min，吸出上清液到新的EP管，加入200 μl氯仿，用力震蕩15 s，放置3 min；4℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清液加500 μl異丙醇，混勻，放置10 min，4℃，12 000 r/min，離心10 min，棄去上清液；用75%的乙醇清洗沉淀2次，4℃，7 500 r/min，離心5 min，風干后用DEPC水溶解，并測OD值；分裝后-80℃保存。逆轉錄反應嚴格按照試劑盒說明書進行操作，布板，然后利用熒光定量PCR軟件進行分析，觀察擴增曲線。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組學習記憶能力比較 與假手術組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長，跨原平臺次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，歸芪聰志湯中劑量組、陽性對照組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，跨原平臺次數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中歸芪聰志湯中劑量組明顯優(yōu)于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組逃避潛伏期、跨原平臺次數(shù)比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與陽性對照組比較：3)P<0.05，下表同

圖1 各組海馬神經(jīng)元形態(tài)結構(HE，×400)

2.2各組海馬神經(jīng)元形態(tài)結果比較 見圖1。假手術組海馬區(qū)組織結構完整，神經(jīng)元數(shù)目和形態(tài)正常，排列整齊，神經(jīng)元樹突正常，分支較多，細胞核大而圓，核仁清晰，HE染色均勻。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元大部分變性壞死，數(shù)目顯著減少，排列紊亂，神經(jīng)元樹突大量缺失，分支較少，細胞核固縮、深染，核仁消失。與模型組相比，歸芪聰志湯各劑量組和陽性對照組神經(jīng)元損傷減輕，神經(jīng)元數(shù)目及其樹突增多，細胞核固縮現(xiàn)象減輕，其中歸芪聰志湯中劑量組和陽性對照組較歸芪聰志湯高、低劑量組神經(jīng)元更加完整。

2.3各組海馬組織HIF-1α、VEGF、HO-1蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組HIF-1α、VEGF和HO-1的陽性細胞數(shù)表達均明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，各治療組HIF-1α、VEGF和HO-1的陽性細胞數(shù)表達均增多，其中歸芪聰志湯中劑量組、陽性對照組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，歸芪聰志湯中劑量組HIF-1α、VEGF和HO-1的陽性細胞數(shù)表達均顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2，圖2、圖3、圖4。

表2 各組海馬組織HIF-1α、VEGF、HO-1蛋白表達比較(每高倍鏡下陽性細胞個數(shù)，

圖2 各組海馬組織HIF-1α蛋白表達比較(DAB，×400)

圖3 各組海馬組織VEGF蛋白表達比較(DAB，×400)

圖4 各組海馬組織HO-1蛋白表達比較(DAB，×400)

2.4各組海馬組織HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表達比較 與假手術組比較，模型組HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表達量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，歸芪聰志湯高劑量組與陽性對照組HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表達量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組海馬組織HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表達比較

3 討 論

腦血管疾病導致的腦組織缺血缺氧是VD的主要病因〔5〕。低氧環(huán)境下，機體會產(chǎn)生一系列適應反應以維持氧穩(wěn)態(tài)，而HIF-1是氧分壓的主傳感器，其中HIF-1α是直接感受缺氧的感受器〔6〕。HIF-1α通過調(diào)控靶基因的表達激活相關信號通路使機體對缺氧的耐受及維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。目前已知的受HIF-1α調(diào)控的靶基因有130余種，其中對VEGF的調(diào)控尤為重要〔7〕，VEGF是由細胞產(chǎn)生的能刺激新生血管形成的化學因子，而血管生成又保護了殘存的神經(jīng)細胞，并對學習記憶相關的要害部位皮層、海馬、小腦的各種神經(jīng)細胞發(fā)揮直接的神經(jīng)營養(yǎng)性效應和神經(jīng)再生作用〔8〕。Manoonkitiwongsa等〔9〕還發(fā)現(xiàn)VEGF具有獨立于血管形成之外的神經(jīng)保護作用。另外，HIF-1α的靶基因HO-1是血紅素分解代謝過程中的限速酶，它可以使血紅素分解代謝產(chǎn)生一氧化碳(CO)、膽綠素(迅速轉變?yōu)槟懠t素和游離鐵)、鐵結合蛋白〔10〕，適量的CO在存在于腦組織中，能使血管擴張、抑制血小板的聚集、減少脂質過氧化和蛋白質氧化，從而發(fā)揮其細胞保護作用，而生理濃度范圍內(nèi)的膽紅素和膽綠素是體內(nèi)強有力的抗氧化劑〔11〕，并有研究發(fā)現(xiàn)海馬注射重組腺相關病毒介導HO-1基因，可增加慢性缺血大鼠海馬組織超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛、一氧化氮含量，減少氧化應激損傷〔12〕。本研究表明歸芪聰志湯治療VD的機制可能與促進HIF-1α、VEGF、HO-1的表達相關，也可能與促進HIF-1α的表達，從而激活其靶基因VEGF、HO-1，最終激發(fā)腦內(nèi)的神經(jīng)修復機制相關。

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7Higashida T，Kreipke CW，Rafols JA，etal.The role of hypoxia-inducible factor-1a，aquaporin-4 and matrix metalloproteinase-9 in blood-brain barrier disruption and brain edema after traumatic brain injury：laboratory investigation〔J〕.J Neurosurg，2011；114(1)：92-101.

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9Manoonkitiwongsa PS，Schultz RL，McCreery DB，etal.Neuroprotection of ischemic brain by vascular endothelial growth factors is critically dependent on proper dosage and may be compromised by angiogenesis〔J〕.J Cerebral Blood Flow,2004；24(6)：693-702.

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