汪 靜

(武漢市艾格眼科醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

隨著我國人口老齡化加劇，年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病率明顯提升〔1〕，但其發(fā)病機制仍未明確。目前研究認為，晶狀體上皮細胞凋亡是白內(nèi)障發(fā)病的始動環(huán)節(jié)和病理生理改變基礎(chǔ)〔2〕。miRNA是一類內(nèi)源性具有調(diào)控作用的非編碼RNA，可通過介導(dǎo)靶基因表達來發(fā)揮作用。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)多種miRNA通過對人晶狀體上皮細胞凋亡發(fā)揮調(diào)控作用，影響白內(nèi)障進程〔3〕。動物實驗表明，miR-126參與調(diào)控大鼠繼發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病過程〔4〕，但對人白內(nèi)障形成的影響和作用機制仍未明確。鋅指蛋白kruppel樣因子(KLF)6基因可參與哺乳動物體內(nèi)細胞凋亡、衰老等生理過程的調(diào)節(jié)，緩解多種年齡相關(guān)性疾病進展〔5〕。相關(guān)研究顯示，在人晶狀體上皮細胞氧化損傷狀態(tài)下，上調(diào)KLF6表達水平可有效抑制細胞凋亡〔6〕，可見KLF6能夠抑制白內(nèi)障病情發(fā)展。本次研究使用miR-126模擬物、抑制物轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細胞系HLEB3，分析miR-126對HLEB3凋亡的影響并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人晶狀體上皮細胞系HLEB3購于上海晶都生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于北京雅安達生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體2000購于上海依赫生物科技有限公司；Trizol試劑盒、SYBR?Green Kit試劑盒購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；兔抗人KLF6多克隆抗體、小鼠免疫球蛋白(Ig)G二抗購于北京安必奇生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HLEB3培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，放入37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的HLEB3接種到6孔板，調(diào)整細胞濃度至40%～60%并進行轉(zhuǎn)染。使用脂質(zhì)體2000分別將100 nmol/L的miR-126 mimic(模擬物組)、miR-126 mimic Control(模擬物陰性對照組)、miR-126 inhibitor(抑制物組)、miR-126 inhibitor Control(抑制物陰性對照組)轉(zhuǎn)染到HLEB3中，向每個培養(yǎng)孔中加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至終濃度體積為2 ml，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細胞。

1.2.2氧化凋亡模型構(gòu)建 向不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入3%H2O2配制成終濃度為0.3 mmol/L的H2O2DMEM培養(yǎng)基，分別加入到轉(zhuǎn)染后的各組HLEB3中，同時設(shè)置凋亡模型組(使用未轉(zhuǎn)染的HLEB3構(gòu)建凋亡模型)和正常HLEB3組(用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng))，各組均放入37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)12 h，收集細胞。透射電解下觀察凋亡模型組和正常HLEB3組的細胞形態(tài)，驗證凋亡模型是否成功建立。

1.2.3qRT-PCR檢測 Trizol試劑盒收集各組細胞，按說明書要求提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用SYBR?Green Kit試劑盒，RNU6B為內(nèi)參照檢測miR-126的相對表達量，β-actin為內(nèi)參檢測KLF6 mRNA的相對表達量。miR-126、RNU6B、KLF6、β-actin的特異性上、下游引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件：95℃ 40 s，95℃ 10 s，55℃ 35 s，共40個循環(huán)，2-△△Ct法計算miR-126、KLF6 mRNA的相對表達量。

1.2.4Western印跡檢測 取各轉(zhuǎn)染組HLEB3，加入RIPA細胞裂解液靜置40 min，4℃下12 000 r/min恒溫離心30 min、取上清；行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗人KLF6多克隆抗體(1∶200)，4℃緩慢搖動孵育過夜，加入HRP標記的小鼠IgG二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，以GADPH為內(nèi)參，采用Image J計算目標各帶灰度值。

1.2.5細胞凋亡檢測 胰蛋白酶消化各轉(zhuǎn)染組細胞，磷酸緩沖液洗滌、2 000 r/min離心10 min、棄上清。使用結(jié)合緩沖液將細胞濃度調(diào)整至1×105/ml，滴加5 μl Annexin V-FITC/PI雙染試劑，常溫下避光靜置20 min，將細胞轉(zhuǎn)移至冰上，分別加入500 μl 的結(jié)合緩沖液，混合均勻后放入流式細胞儀中檢測各轉(zhuǎn)染組HLEB3凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1HLEB3凋亡模型形態(tài)學(xué)觀察及miR-126表達情況 電鏡下細胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，正常HLEB3組形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形，細胞膜結(jié)構(gòu)完整，表面可見較多絨毛突起，細胞核清晰，染色體分布均勻，胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體豐富，無凋亡改變，見圖1A、圖1B；凋亡模型組表面微絨毛明顯減少，細胞核體積減小且形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)匯集，存在凋亡特異性標志物-凋亡小體，見圖1C、圖1D。凋亡模型組中miR-126相對表達量為3.39±0.61，明顯高于正常HLEB3組(1.20±0.42，P<0.01)。

圖1 正常HLEB3和凋亡模型透射電鏡下形態(tài)表現(xiàn)(×6 300)

2.2HLEB3轉(zhuǎn)染效率評定 轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，qRT-PCR檢測各組miR-126表達情況。結(jié)果顯示，模擬物組miR-126相對表達量(89.61±12.95)明顯高于模擬物陰性對照組(3.75±0.82，P<0.01)；抑制物組miR-126相對表達量(0.52±0.15)明顯低于抑制物陰性對照組(3.16±1.24，P<0.01)。

2.3miR-126對HLEB3凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測顯示，模擬物組HLEB3凋亡率〔(0.62±0.11)%〕低于模擬物陰性對照組〔(1.45±0.17)%,P<0.05〕；抑制物組HLEB3凋亡率〔(2.48±0.45)%〕高于抑制物陰性對照組〔(1.52±0.13)%,P<0.05〕。

2.4miR-126靶基因預(yù)測 使用目前引用次數(shù)最高的miRNA靶基因預(yù)測軟件(miRanda、miRecords、miRWalk)對 miR-126 靶基因進行預(yù)測，KLF6基因與miR-126存在潛在結(jié)合位點，可能通過靶向調(diào)控KLF6來影響HLEB3凋亡。

2.5miR-126對HLEB3中KLF6 mRNA和蛋白表達的影響 模擬物組HLEB3中KLF6 mRNA相對表達量(0.72±0.17)明顯低于模擬物陰性對照組(1.03±0.05)；抑制物組KLF6 mRNA相對表達量(1.95±0.20)，明顯高于抑制物陰性對照組(1.10±0.09，均P<0.05)。模擬物組HLEB3中KLF6 蛋白相對表達量(1.95±0.58)明顯低于模擬物陰性對照組(3.16±0.75)；抑制物組KLF6 蛋白相對表達量(4.82±0.37)明顯高于抑制物陰性對照組(3.20±0.59，均P<0.05)。見圖2。

1為模擬物組，2為模擬物陰性對照組，3為抑制物陰性對照組，4為抑制物組圖2 各組KLF6蛋白表達的Western印跡電泳圖

3 討 論

隨著我國人口老齡化加劇，白內(nèi)障發(fā)病率和總患者數(shù)逐年提升，探尋白內(nèi)障發(fā)病機制，對病情防治具有重要意義〔7〕。miRNA在哺乳動物中具有高度同源性，能夠與其靶基因配對結(jié)合并抑制翻譯過程、下調(diào)靶基因表達水平，導(dǎo)致基因沉默。最新研究發(fā)現(xiàn)miR-126不僅存于肺癌、肝細胞癌、卵巢癌等多種癌組織中，還分布于哺乳動物眼部，在晶狀體、角膜上皮細胞中〔8〕。動物實驗發(fā)現(xiàn)，白內(nèi)障大鼠的晶狀體中miR-126是表達上調(diào)最明顯的miRNA之一〔9〕，提示其參與白內(nèi)障進程的可能性較大，但具體機制仍未明確。

本研究顯示，在HLEB3凋亡模型中，miR-126表達水平明顯高于正常HLEB3；進一步在HLEB3凋亡模型中調(diào)節(jié)miR-126的表達水平，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-126表達會明顯促進HLEB3凋亡，下調(diào)miR-126表達則明顯降低HLEB3凋亡。筆者通過靶基因預(yù)測軟件得到KLF6基因為miR-126的潛在結(jié)合位點，KLF6是一種多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在組織抗氧化損傷、維持細胞結(jié)構(gòu)完整和穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，KLF6基因在成年大鼠和人晶狀體上皮細胞中均存在高表達〔10〕。本次研究對miR-126可能通過潛在靶基因KLF6調(diào)控HLEB3凋亡過程的研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-126表達會明顯降低KLF6基因表達水平，而下調(diào)miR-126表達會提升KLF6基因表達水平，提示KLF6基因表達與miR-126呈負相關(guān)，miR-126可通過靶向作用于KLF6基因來調(diào)控HLEB3凋亡，進而在白內(nèi)障發(fā)病機制中發(fā)揮作用，可成為白內(nèi)障治療的潛在新靶點。

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