孫 軍 溫昌明 張保朝 聞公靈 周 靜

(南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽 473003)

缺血性腦血管病的治療方法主要包括溶栓治療、降纖藥物治療、抗血小板治療、抗凝治療、中藥治療及外科手術(shù)治療等。溶栓治療是指通過血管再通恢復(fù)局部供血，但進行再灌注則會加重缺血組織的進一步損傷〔1〕。局灶性腦缺血再灌注損傷中先天性免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)起著重要作用〔2～4〕。Toll樣受體(TLR)4在炎癥反應(yīng)中起重要作用，缺血再灌注中，TLR4/核因子(NF)-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可引起NF-κB轉(zhuǎn)移，NF-κB的活化可進一步誘導(dǎo)白細胞介素(IL)-6、IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子的表達，引起炎癥反應(yīng)并加重損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡〔5，6〕。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ是一種配體激活型核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族，在體內(nèi)多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用〔7〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑在多種臟器缺血再灌注損傷動物模型中，能減輕其缺血再灌注病理損傷，說明PPARγ具有抑制炎癥反應(yīng)和炎性因子表達的功能〔8〕。本試驗觀察吡格列酮對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及對大鼠外周血中IL-6、TNF-α含量及腦組織中TLR4、NF-κB表達的影響，探討其腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 吡格列酮購于連云港德源藥業(yè)有限責(zé)任公司，TLR4、NF-κB抗體購自英國Abcam公司，鼠抗IL-6、TNF-α單克隆抗體、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購于武漢博士德公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G購于中杉金橋，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購于美國R&D公司，Trizol Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimerScriptTM RT reagent Kit)、熒光定量試劑(SYBR Green I)購于日本TaKaRa公司。低溫高速離心機購于北京醫(yī)用離心機廠，Multiskan MK3 型酶標(biāo)儀購于芬蘭 Thermo Labsys2tems公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購于瑞士Roche公司。

1.2大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型制備 術(shù)前12 h禁食，自由飲水，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg)大鼠，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，結(jié)扎CCA和ECA，在ECA結(jié)扎點近端用1 ml注射器針頭刺一小口，將選取好的栓線自左ECA 插入CCA分叉處，固定線栓，剪斷ECA結(jié)扎點近心端。調(diào)整方向，將線栓插入左ICA，輕柔推進，長度約為(18±0.5)mm，阻斷大腦中動脈，造成局灶性腦缺血。阻斷2 h后，拔出栓線，進行再灌注。假手術(shù)組僅進行麻醉和血管分離，不導(dǎo)入栓線。造模后將大鼠放入干凈的飼養(yǎng)籠中，術(shù)中、術(shù)后注意保暖，自由采食和飲水。

1.3動物分組及給藥 體重250～300 g的雄性健康SD大鼠60只，隨機分為假手術(shù)組、模型組、生理鹽水干預(yù)組(造模前3 d及術(shù)前1 h灌胃給予生理鹽水2 ml)、吡格列酮治療組〔造模前3 d及術(shù)前1 h灌胃給藥(吡格列酮片15 mg/kg)〕各15只。

1.4神經(jīng)功能缺損評分 觀察并記錄大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀；0分，無神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分，對側(cè)前爪不能完全伸直；2分，行走時向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，向病灶對側(cè)跌倒；4分，意識喪失，不能自發(fā)活動；5分，死亡。取評分在1～3分者納入研究。

1.5腦梗死體積的測定 每組隨機取5只大鼠，用水合氯醛麻醉后快速斷頭取腦，置于-20℃冰箱中冷凍。以2 mm間距冠狀切成5片，將大腦切片浸泡在2%氯化三苯基四氮唑(TTC)緩沖液中，放入37℃烘箱中避光孵育30 min。以4%多聚甲醛固定，腦梗死組織為白色，正常腦組織顯示為紅色。相機拍照采集圖像后用Image J1.37圖像分析軟件，計算梗死體積百分比(腦梗死體積/對側(cè)腦體積)。

1.6大鼠血清抽取及組織切片制備 4組再灌注24 h后，用水合氯醛麻醉打開胸腔，抽取心臟血2 ml，待常溫凝固1 h后，3 000 r/min離心20 min，取上清液，用于ELISA檢測。取血之后，剝離腦組織，先用生理鹽水100 ml沖洗，然后用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，用于免疫組化染色。

1.7ELISA測定血清IL-6和TNF-α的濃度 血清IL-6和TNF-α濃度采用雙抗體夾心SABC-ELISA法測定，按照試劑盒說明書操作步驟進行。用酶標(biāo)儀測定450 nm處測OD值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中IL-6、TNF-α濃度。

1.8免疫組化技術(shù)檢測腦組織TLR4和NF-κB 蛋白的表達 大鼠腦組織按照常規(guī)固定、石蠟包埋、切片后，采用SABC法檢測TLR4和NF-κB蛋白的表達。按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書操作步驟，用3%去離子水過氧化氫孵育10 min清除內(nèi)源性過氧化物酶；3%牛血清白蛋白(BSA)室溫孵育封閉1 h；分別加入TLR4和NF-κB 鼠單克隆抗體(1∶100)4℃過夜，滴加適當(dāng)比例的辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG室溫孵育1 h，滴加SABC復(fù)合物室溫反應(yīng)30 min；DAB顯色，酒精脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.9實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測腦組織TLR4和NF-κB mRNA的表達 取大鼠再灌注24 h后的腦組織，用Trozol法提取組織總RNA，總RNA質(zhì)量用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測；采用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作5倍稀釋用于后續(xù)熒光定量PCR分析。 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的大鼠TLR4、NF-κB 和β-actin的mRNA序列為模板，按照目的片段橫跨兩個外顯子的原則，用oligo6.0軟件設(shè)計RT-PCR引物(表1)。所有引物由大連寶生物工程有限公司合成。RT-PCR擴增條件：預(yù)變性95℃×5 min，變性95℃×30 s，退火60℃×30 s，延伸72℃×30 s，均為35個循環(huán)。用β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析，即基因表達差異=2-△△Ct，△△Ct=實驗組(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)-對照組(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)。

表1 實時熒光定量RT-PCR引物信息

1.10數(shù)據(jù)分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能評分比較 模型組及生理鹽水干預(yù)組均表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)運動功能障礙，術(shù)后神經(jīng)功能評分〔(2.3±0.69)分、(2.5±0.62)分〕顯著高于假手術(shù)組(0分，P<0.01)，說明造模成功；而吡格列酮治療組神經(jīng)功能損傷癥狀明顯改善，術(shù)后神經(jīng)功能評分〔(1.5±0.73)分〕顯著低于模型組和生理鹽水干預(yù)組(P<0.05)。

2.2各組腦梗死體積比比較 假手術(shù)組腦組織切片經(jīng)TTC染色全部呈紅色，無梗死灶形成；模型組和生理鹽水干預(yù)組腦組織染色可見有明顯的白色梗死灶，主要位于右側(cè)額葉、頂葉皮質(zhì)及紋狀體；吡格列酮治療組腦組織梗死灶體積比〔(14.69±0.94)%〕顯著低于模型組〔(41.65±1.38)%〕和生理鹽水干預(yù)組〔(37.21±2.26)%,P<0.05〕。

2.3各組血中 IL-6和TNF-α濃度比較 與假手術(shù)組相比，模型組和生理鹽水干預(yù)組血清 IL-6和TNF-α含量都顯著升高(P<0.01)；與生理鹽水干預(yù)組、模型組相比，吡格列酮治療組血清IL-6和TNF-α含量都顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α濃度比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；與生理鹽水治療組比較：3)P<0.05，下表同

2.4各組腦組織TLR4和NF-κB 蛋白表達免疫陽性細胞數(shù)比較 TLR4、NF-κB 免疫組化陽性表達呈棕黃色，陽性細胞染色主要位于胞膜及胞質(zhì)。假手術(shù)組偶見TLR4、NF-κB 免疫陽性細胞，模型組及生理鹽水干預(yù)組TLR4、NF-κB 免疫陽性細胞顯著增加(P<0.01)，吡格列酮治療組TLR4、NF-κB 免疫陽性細胞明顯減少(P<0.05)，見表3及圖1。

表3 各組腦組織TLR4、NF-κB 免疫陽性細胞個數(shù)比較

圖1 各組腦組織TLR4、NF-κB免疫陽性細胞個數(shù)(SABC法，×200)

2.5各組腦組織TLR4和NF-κB mRNA表達比較 與假手術(shù)組相比，模型組和生理鹽水干預(yù)組腦組織中TLR4、NF-κB mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.01)，吡格列酮治療組TLR4、NF-κB mRNA表達與模型組和生理鹽水干預(yù)組相比顯著下調(diào)(P<0.05)。見表4。

表4 各組腦組織TLR4、NF-κB mRNA表達比較

3 討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)有多種藥物如芒果苷〔9〕、葛根素〔10〕、芹菜素〔11〕、熊果酸〔12〕等對腦缺血再灌注損傷都有一定的保護作用，PPARγ激動劑也是在缺血性腦損傷中研究較多的一種藥物。已有大量研究證明，PPARγ激動劑WY14643、羅格列酮、吡格列酮等對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，可以抑制炎癥反應(yīng)，減少組織損傷等。邱林等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可以促進缺血再灌注腦組織中PPARγ的表達水平，降低腦組織炎性因子的水平；李萌等〔14〕認為吡格列酮可改善缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能異常，減輕腦水腫并促進損傷腦細胞的恢復(fù)。本研究結(jié)果說明吡格列酮具有腦保護作用，這與文獻〔13，14〕報道的結(jié)果一致。

研究〔15〕表明氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、鈣超載、能量代謝紊亂、酸中毒、細胞凋亡等與缺血再灌注腦損傷的發(fā)生密切相關(guān)，其中研究最多的是炎癥反應(yīng)。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷可能與腦細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)〔16，17〕。TLR4受到刺激后會導(dǎo)致炎性細胞因子分泌增多，參與缺血性腦損傷中的炎癥反應(yīng)、神經(jīng)功能損傷和神經(jīng)細胞凋亡。NF-κB參與調(diào)控多種炎癥反應(yīng)及細胞因子，與腦缺血再灌注損傷有密切關(guān)系，腦缺血時會誘發(fā)NF-κB的活化，促使黏附分子、細胞表面受體、趨化因子和細胞因子表達增加，進一步加重缺血區(qū)的腦損傷程度。研究證實TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血再灌注損傷過程中起著重要的作用〔18〕，劉軍等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，TLR4對缺血再灌注損傷導(dǎo)致的細胞凋亡具有保護作用。余偉軍等〔20〕發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可能通過降低NF-κB活性，抑制炎癥反應(yīng)，減少細胞凋亡，從而在腦缺血再灌注損傷后，對神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用。綜上，TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活會加重腦缺血再灌注的炎癥損傷。

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