鄒 瑩

(白城醫(yī)學高等專科學校，吉林 白城 137000)

白內(nèi)障的發(fā)生機制與年齡、氧化作用、外傷等多種因素有關(guān)，其中年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病機制包括氧化應激、細胞凋亡、鈣蛋白酶激活等。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在人晶狀體上皮細胞(LECs)的凋亡過程中發(fā)揮不同程度的調(diào)控作用，如miR-125通過抑制靶基因p53的表達來抑制LECs的凋亡〔1〕。miR-204表達于LECs中，通過Meis-2調(diào)控PAX6的轉(zhuǎn)錄，影響晶狀體分化〔2〕。目前關(guān)于miR-204在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病過程中與氧化損傷的關(guān)系及作用機制的研究鮮有報道，我們通過前期實驗，用生物信息學預測分析軟件RASMOL、ICMLite、CrystInfo共同預測了TP53INP1是miR-204的靶基因之一，同時使用Active Motif 雙熒光素酶報告基因驗證了該結(jié)果。本研究擬探討miR-204對年齡相關(guān)性白內(nèi)障氧化損傷的抑制作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 2015年10月至2016年3月在本院行白內(nèi)障手術(shù)的30例皮質(zhì)性年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的晶狀體前囊膜標本；取同期本院眼庫收集的30例正常供體眼球晶狀體前囊膜標本。本次研究經(jīng)本院倫理委員會批準，患者均自愿參與并簽署知情同意書。主要試劑：HLE-B3 LECs(廣州吉賽生物科技有限公司)；DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(上海哈靈生物科技有限公司)；兔抗人TP53INP1一抗、p53一抗(上海博耀生物科技有限公司)；HRP標記的羊抗兔二抗(上海科興生化試劑有限公司)；ECL發(fā)光試劑盒、RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒(上海靜融生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR檢測 將收集到的標本放于裂解液中裂解，使用RNA提取試劑盒獲取囊膜中的總RNA，用分光光度法檢測提取RNA的純度。收集1 μl Oligo(dT)和7 μl總RNA，按M-MLV步驟逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。加入Mix 4.0 μl、miR-204 0.3 μl、GAPDH 0.3 μl、上下游引物各0.3 μl。去RNA酶水4.4 μl和cDNA 1.0 μl建立反應體系。常規(guī)擴增條件，共40個循環(huán)，計算目的基因的相對表達量。

1.2.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HLE-B3細胞復蘇后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放于37℃，5% CO2濃度的細胞培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期細胞以1×105/孔加入到6孔板中。取1 nmol miR-204擬似物、拮抗物和對照RNA轉(zhuǎn)染試劑溶于50 μl無菌蒸餾水中分裝。細胞生長到40%～50%融合時，分為正常對照組和miR-204擬似物組、miR-204拮抗物組、擬似物對照組、拮抗物對照組。對照組不加轉(zhuǎn)染試劑，另外4組將稀釋的轉(zhuǎn)染試劑加入相應培養(yǎng)孔中，終濃度分別為10、50、100、150 nmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)1 d，用實時熒光定量PCR檢測細胞中miR-204表達量進而驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3細胞模型建立與分組 取對數(shù)期HLE-B3細胞，以1×105/孔加入到6孔板中，生長至80%融合時，每孔加入3% 過氧化氫，終濃度200 μmol/L處理6 h，建立體外LECs氧化損傷模型，并分為模型對照組、miR-204擬似物組、miR-204拮抗物組、擬似物對照組、拮抗物對照組，過氧化氫(未經(jīng)H2O2)處理的細胞為正常對照組。H2O2作用6 h后，棄去上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，換DMEM培養(yǎng)液，孵育12 h。

1.2.4細胞凋亡檢測 經(jīng)H2O2處理后的各組轉(zhuǎn)染細胞中加入胰酶消化為單細胞懸液，每組細胞數(shù)約1×105個，2 000 r/min離心10 min，棄去培養(yǎng)液。PBS沖洗2次，避光染色30 min，置于流式細胞儀中檢測細胞凋亡情況，波長488 nm，繪制流式細胞儀圖，計算細胞凋亡率。

1.2.5細胞中TP53INP1 mRNA和p53 mRNA表達量檢測 使用RNA提取試劑盒抽提總mRNA，紫外分光光度法檢測純度。cDNA合成試劑盒mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，特異性引物行實時熒光定量PCR檢測TP53INP1 mRNA、p53mRNA的表達量，以GAPDH為內(nèi)參。常規(guī)反應條件下共45個循環(huán)，計算目的基因的相對表達量。

1.2.6細胞中TP53INP1 mRNA和p53蛋白表達檢測 采用Western印跡法進行檢測，各組細胞中加入100 μl細胞裂解液后提取總蛋白，BCA法測定濃度。取10 μg蛋白行聚丙酰胺凝膠電泳，將目標蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶5 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加二抗(1∶5 000稀釋)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液顯影5 min，暗室曝光、洗片。以GAPDH為內(nèi)參，計算目標蛋白灰度值。

1.3統(tǒng)計學分析 使用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-204 mRNA在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體組織中的表達 白內(nèi)障患者miR-204 mRNA表達量(0.57±0.05)明顯低于正常人(1.38±0.06，P<0.05)。

2.2細胞轉(zhuǎn)染后miR-204 mRNA的表達情況 正常對照組、miR-204擬似物組、miR-204拮抗物組、擬似物對照組、拮抗物對照組細胞中miR-204 mRNA表達量分別為1.10±0.01、5.32±0.47、0.56±0.08、0.96±0.45、1.47±0.29，其中miR-204擬似物組明顯高于擬似物對照組(P<0.01)，miR-204拮抗物組明顯低于拮抗物對照組(均P<0.01)。

2.3LECs凋亡情況 正常對照組、模型對照組、miR-204擬似物組、擬似物對照組、miR-204拮抗物組、拮抗物對照組LECs凋亡率〔(1.29±0.11)%、(4.85±0.37)%、(2.55±0.13)%、(4.30±0.19)%、(5.72±0.22)%、(4.25±0.53)%〕差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，模型對照組明顯高于正常對照組，miR-204擬似物組明顯低于擬似物對照組；miR-204拮抗物組明顯明顯高于拮抗物對照組(P<0.05)，但擬似物對照組和拮抗物對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4各組LECs中TP53INP1和p53 mRNA及蛋白表達情況 各組間TP53INP1和p53 mRNA及蛋白的表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中模型對照組明顯高于正常對照組(P<0.01)；miR-204擬似物組明顯低于擬似物對照組，miR-204拮抗物組明顯高于拮抗物對照組(P<0.05)。見圖1、表1。

1正常對照組；2 模型對照組；3 miR-204擬似物組；4 擬似物對照組；5 miR-204拮抗物組；6 拮抗物對照組圖1 各組LECs中TP53INP1和p53蛋白表達電泳圖

組別目的基因TP53INP1p53目的蛋白TP53INP1p53正常對照組079±021076±020100±000100±000模型對照組142±0131)246±0251)160±0171)286±1221)miR?204擬似物組073±0022)063±0232)077±0052)139±0202)擬似物對照組135±006219±019143±025262±026miR?204拮抗物組170±0283)330±0283)185±0033)280±0023)拮抗物對照組125±019261±053130±022251±005

與正常對照組比較:1)P<0.05；與擬似物對照組比較:2)P<0.05；與拮抗物對照組比較:3)P<0.05

3 討 論

白內(nèi)障發(fā)生機制中氧自由基損傷發(fā)揮重要作用，晶狀體氧化損傷的可能機制為細胞凋亡的信號通路被氧自由基激活，生物膜受損，鈣泵功能障礙，導致胞內(nèi)鈣離子平衡被破壞，引發(fā)細胞凋亡。白內(nèi)障患者房水中H2O2濃度明顯高于正常人，而H2O2在體外可誘導細胞凋亡，常被用于氧化損傷模型的建立。

miRNA作為內(nèi)源性非編碼RNA分子，參與細胞增殖、凋亡等過程，與多種疾病之間存在相關(guān)性。miRNA可參與白內(nèi)障的發(fā)生與發(fā)展，但miR-204與白內(nèi)障損傷發(fā)生機制的關(guān)系仍未明確。相關(guān)研究顯示，miR-204參與晶狀體分化及視盤發(fā)育的調(diào)控，可能通過作用于MEIS-2基因來調(diào)控PAX6基因轉(zhuǎn)錄，影響晶狀體分化〔3〕。本研究說明與年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。miR-204擬似物可上調(diào)miR-204表達水平；miR-204拮抗物可下調(diào)miR-204表達水平。人LECs轉(zhuǎn)染miR-204擬似物后胞內(nèi)miR-204表達水平上調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-204拮抗物的結(jié)果正好相反；提示miR-204參與了LECs氧化損傷過程中的細胞凋亡，相關(guān)研究顯示，miR-125b能夠抑制基因p35表達，調(diào)控LECs凋亡，本次研究中miR-204與TP53INP1表達水平相反，說明miR-204可負向調(diào)節(jié)TP53INP1靶基因，進而參與LECs氧化損傷過程，推測miR-204表達上調(diào)對LECs凋亡抑制作用的機制可能通過部分生物信號發(fā)揮作用。

TP53INP1在p53誘導細胞凋亡中起重要作用，當細胞處在應激極化狀態(tài)時該轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)。TP53INP1是多種miRNAs的靶基因，如在乳腺癌發(fā)病過程中miR-125b調(diào)控TP53INP1的表達起重要作用〔4〕；在白血病發(fā)病過程中，miR-93調(diào)控TP53INP1發(fā)揮關(guān)鍵作用〔5〕。本研究證實了TP53INP1是miR-204的靶基因；在H2O2處理的LECs中TP53INP1 mRNA和蛋白表達明顯高于正常LECs，進一步證實了細胞應激狀態(tài)下TP53INP1表達上調(diào)的現(xiàn)象。p53是細胞凋亡的重要調(diào)控基因，可參與調(diào)控整個細胞周期，加速DNA修復和細胞應激反應后的衰老過程〔6〕。本研究說明氧化損傷細胞中p53被激活，進而激活靶基因TP53INP1，通過調(diào)控細胞凋亡參與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。

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