羅海龍 姜愛英 賈 茜 郭艷芹 畢鵬翔 張忠敏 董 妍

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157000)

癲癇是以神經(jīng)元過度放電所導(dǎo)致的突然反復(fù)發(fā)作和暫時性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性神經(jīng)系統(tǒng)常見病〔1〕。癲癇發(fā)病率與性別和年齡的關(guān)系較為密切，一般來講，女性患病率高于男性，1 歲內(nèi)患病率高，隨著年齡逐漸增高，而患病率呈逐漸下降趨勢，在老年人群患病率較低〔2〕。如長期反復(fù)發(fā)作或是癲癇持續(xù)狀態(tài)，可引起患者語言、記憶甚至學(xué)習(xí)等認(rèn)知功能障礙及導(dǎo)致海馬和(或)顳葉神經(jīng)出現(xiàn)異常，但是目前關(guān)于癲癇的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明〔3,4〕。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致癲癇發(fā)作的一個重要原因?yàn)镹-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體過度激活〔5,6〕。NMDA受體阻斷具有明顯的神經(jīng)元保護(hù)作用，并抑制神經(jīng)元泛連接蛋白(Panx)-1表達(dá)〔7〕。本研究旨在研究NMDA受體阻斷對癲癇大鼠行為學(xué)、腦電圖及海馬和顳葉Panx-1表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級雄性SD大鼠70只，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供(通過牡丹江醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員批準(zhǔn))，實(shí)驗(yàn)動物合格證號為：P00102008，生產(chǎn)許可證號：SCXK(黑)2015-001，使用許可證號：SYXK(黑)2015-007。空調(diào)恒溫室內(nèi)22℃，相對濕度50%，自由飲食，通風(fēng)換氣20次/h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑 NMDA受體拮抗劑MK-801(地卓西平，純度>98.0%)購于美國Apexbio公司；Panx-1抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于美國Sigma公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國Amersham Bioscience公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；二辛可寧酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3主要儀器 動物立體定向儀(ALC-H，北京吉安得爾科技有限公司)；多道生理信號采集處理系統(tǒng)購自(RM6240型，成都儀器廠)；蛋白成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS，美國BIO-RAD公司)；轉(zhuǎn)膜儀(VE-186，上海天能科技有限公司)；電泳儀(PowerPac HV，美國BIO-RAD公司)。

1.4大鼠癲癇模型復(fù)制 SD大鼠60只術(shù)前禁食12 h，不禁水。稱重后，腹腔注射10% 水合氯醛(4 ml/kg)麻醉后，仰臥位固定于腦立體定位儀上，剪毛，絡(luò)合碘消毒皮膚，沿大鼠頭部正中線作1 cm 的縱向切口，暴露前囟和冠狀縫。以微量注射器于大鼠右側(cè)海馬CA3中心區(qū)(前囟后3.8 mm，中線旁4.9 mm，顱骨下7.0 mm)處在10 min內(nèi)緩慢注射海人酸(0.5 μg/μl)2 μl，術(shù)后縫合頭皮，肌注青霉素以預(yù)防感染〔8〕。正常對照組(n=10)以生理鹽水代替海人酸注射，余操作與以上相同。

1.5模型復(fù)制成功標(biāo)準(zhǔn) 癲癇發(fā)作癥狀擬采用Racine分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：無任何反應(yīng)；Ⅰ級：面部陣攣，包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等；Ⅱ級：Ⅰ級加節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級：Ⅱ級加前肢肌陣攣，但無后肢直立位；Ⅳ級：Ⅲ級加后肢直立位；Ⅴ級：全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，并失去體位控制〔9〕。達(dá)到Ⅳ級為癲癇模型復(fù)制成功。制備模型過程中，如果出現(xiàn)大鼠死亡現(xiàn)象，或者Racine分級未達(dá)到Ⅳ級，則按照隨機(jī)原則補(bǔ)齊大鼠。

1.6分組及給藥 大鼠癲癇模型復(fù)制過程中6只死亡，14只因Racine分級未達(dá)到Ⅳ級而棄用。剩余符合條件的40只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組，每組10只。模型復(fù)制成功后，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組腹腔注射相應(yīng)劑量的MK-801〔10，11〕，正常對照組和模型組腹腔注射等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)21 d。

1.7行為學(xué)觀察 ①按照Racine分級標(biāo)準(zhǔn)，記錄各級別的發(fā)作數(shù)量。②給藥過程中記錄治療平均癲癇發(fā)作時間，平均癲癇發(fā)作時間=發(fā)作總時間/發(fā)作總次。

1.8腦電圖檢測 RM6240型多道生理信號采集處理系統(tǒng)記錄各組大鼠腦電圖波形，并分析腦電圖波形的頻率及波幅。

1.9取材 行為學(xué)觀察及腦電圖檢測后，各組大鼠斷頭取腦，冰上分離海馬及顳葉，-80℃保存，備用。

1.10蛋白質(zhì)Western印跡法檢測海馬和顳葉Panx-1表達(dá) 嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取海馬和顳葉總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定總蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣后進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳完畢后， 濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜至0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉液〔5% 脫脂奶粉封閉+吐溫磷酸鹽緩沖液(PBST)〕封閉2 h。 然后與Panx-1抗體(1∶500稀釋)4℃孵育過夜，反復(fù)吐溫 Tris-緩沖鹽溶液(TBST)漂洗3次，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)孵育2 h。ECL試劑反應(yīng)，X線(暗室)曝光，室溫顯影，定影。ChemiDoc XRS蛋白成像系統(tǒng)對各組條帶進(jìn)行灰度值計(jì)值。以GAPDH抗體(1∶2 000稀釋)為內(nèi)參。

1.11實(shí)時熒光定量PCR(Real Time-PCR)檢測神經(jīng)元Panx-1 mRNA的表達(dá) Trizol試劑提取總RNA，檢測RNA純度，按照Real Time-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成單鏈的cDNA。cDNA產(chǎn)物保存在-20℃。利用Pubmed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。Real Time-PCR反應(yīng)體系：體積為20 μl；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 s，50℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)，最后72℃ 延伸5 min。每個樣本以內(nèi)參基因GAPDH調(diào)整。2-ΔΔCT法定量分析。引物序列Panx-1：正義TCTGCTCCGACCTGAA，反義GAAGAGCGTGTAGATGACC，168 bp；GAPDH：正義GAGGGAAATCGTGCGTGAC，反義GCATCGGAACCGCTCATT，212 bp。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、LDS、Games-Howell檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組Racine分級結(jié)果 與正常對照組比較，模型組Racine分級級別顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組Racine分級級別顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組Racine分級結(jié)果比較(n,n=10)

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；表2同

2.2各組平均癲癇發(fā)作時間 與正常對照組比較，模型組平均癲癇發(fā)作時間顯著延長(P<0.01)；與模型組比較，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組平均癲癇發(fā)作時間顯著縮短(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.3各組腦電圖檢測結(jié)果 與正常對照組比較，模型組腦電頻率顯著降低，腦電波幅顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組腦電頻率顯著升高，腦電波幅顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.4各組海馬和顳葉Panx-1蛋白、mRNA表達(dá) 與正常對照組比較，模型組海馬和顳葉Panx-1蛋白、mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg組海馬和顳葉Panx-1蛋白、mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表2，圖1。

表2 各組癲癇發(fā)作時間、腦電圖檢測及Panx-1蛋白、mRN相對表達(dá)量比較

A.正常對照組；B.模型組；C.MK-801 0.5 mg/kg組；D.MK-801 1.0 mg/kg組；E.MK-801 1.5 mg/kg組圖1 各組Panx-1表達(dá)Western印跡結(jié)果

3 討 論

NMDA 受體主要存在于大腦的神經(jīng)細(xì)胞上，是一種跨膜離子通道型谷氨酸受體，在調(diào)節(jié)大腦學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能及可塑性等發(fā)面具有十分重要的作用，其功能發(fā)生障礙所導(dǎo)致的興奮性神經(jīng)毒性則與智力障礙、精神分裂癥、自閉癥、癲癇等眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)〔12,13〕。癲癇發(fā)生與NMDA受體過度激活有關(guān)，其在癲癇發(fā)生過程中發(fā)揮的作用正受到越來越多的關(guān)注〔14,15〕。在全腦幾乎都有NMDA受體分布，分布最多的位置主要包括大腦皮質(zhì)、紋狀體、杏仁體、顳葉、海馬等〔16〕。NMDA受體是神經(jīng)元中一種重要的配體依賴的電壓門控的選擇性鈣離子通道，具有電壓依賴性的Mg2+阻斷特性及對鈣離子的高通透性，當(dāng)NMDA受體過度激活，解除了內(nèi)源性Mg2+的阻滯作用，過多的神經(jīng)元的突觸后膜發(fā)生同步性去極化，發(fā)生持續(xù)性放電，最后引起癲癇〔17〕。目前有關(guān)于NMDA受體的研究主要集中于藥物對其表達(dá)的影響〔18,19〕。關(guān)于NMDA受體阻斷對癲癇模型大鼠行為學(xué)、腦電圖的影響鮮見報(bào)道。本研究提示NMDA受體阻斷對改善癲癇大鼠癲癇行為及腦內(nèi)神經(jīng)元異常放電產(chǎn)生積極影響。

Panx-1蛋白是縫隙連接半通道蛋白，其主要功能可能是介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞之間異常同步放電，與NMDA受體密切相關(guān)，可以被NMDA受體激活進(jìn)而引起癲癇〔20〕。本研究結(jié)果提示，NMDA受體阻斷可明顯降低癲癇大鼠海馬和顳葉Panx-1和Panx-1 mRNA表達(dá)。

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