何淑珍 黃 磊 阮 丹

(武漢市武昌醫(yī)院(三級醫(yī)院)老年病科，湖北 武漢 430063)

血管并發(fā)癥是引起糖尿病患者致殘和致死的重要因素，而導(dǎo)致血管損傷的原因與血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能障礙關(guān)系密切。因此，改善血管損傷是治療糖尿病血管并發(fā)癥的重要手段。同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)化生長影響因子(TGIF)家族是屬于三氨基酸環(huán)延伸(TALE)超級家族成員，在腫瘤、代謝和組織分化等多種方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔1～3〕。TGIF2是TGIF家族中的重要成員，有研究發(fā)現(xiàn)，TGIF2在糖尿病胰島β細(xì)胞的分化和形成中發(fā)揮促進(jìn)作用〔4〕。然而，在高糖誘導(dǎo)的血管損傷中，目前并未發(fā)現(xiàn)TGIF2是否參與調(diào)控。本研究通過觀察TGIF2在高糖誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染上調(diào)其表達(dá)，觀察其對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 psiCHECK2-TGIF2 3′-UTR質(zhì)粒和空載體陰性對照質(zhì)粒(NC)購于上海派森諾公司。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購于美國ATCG公司，DMEM培養(yǎng)基購于GIBCO公司，熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、β-actin抗體和TGIF2抗體購于北京中杉金橋公司，胎牛血清、Lipofectmine2000和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑購于美國Sigma公司。RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連寶公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞裂解液購于上海碧云天公司，流式細(xì)胞儀和酶標(biāo)儀分別購于美國BD公司和普利萊公司。PCR儀和電泳儀購于美國Bio-Rad公司，倒置顯微鏡購于日本Olympus公司，Transwell小室購于美國Corning公司，紫外分光光度儀購于上海第H儀器廠。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 在溫度為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%環(huán)境下，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待HUVECs細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時，胰酶消化，傳代。取24孔細(xì)胞板，以每孔30 000個細(xì)胞接種。收集生長狀態(tài)良好的HUVECs細(xì)胞進(jìn)行實驗。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，對照組：不做處理；高糖組：25 mmol/L D-葡萄糖干預(yù)；NC高糖組：先轉(zhuǎn)染NC，再加入25 mmol/L D-葡萄糖進(jìn)行干預(yù)；TGIF2高糖組：先轉(zhuǎn)染psiCHECK2-TGIF2 3′-UTR質(zhì)粒，再加入25 mmol/L D-葡萄糖進(jìn)行干預(yù)。參照Lipofectmine2000使用說明將2.5 μl終濃度均為30 nm的psiCHECK2-TGIF2 3′-UTR質(zhì)粒/NC、10 μl Lipofectmine2000和200 μl無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染至siRNA TGIF2高糖組/NC高糖組細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，加入D-葡萄糖處理48 h后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3RT-PCR檢測 采用Trizol法提取各組HUVECs細(xì)胞的總RNA，并采用紫外分光光度計定量其濃度。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。將配制好的20 μl反應(yīng)體系上PCR儀擴(kuò)增。其中，每組設(shè)3個平行孔。β-actin上游引物：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游：5′-GCTGTCACCTTCACCCTTCC-3′；TGIF2上游引物：5′-GGCACCTAGCAGAGAAA-GATAAG-3′，下游：5′-GGGAGGCTGAGGCAAATAAT-3′。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性240 s，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸120 s，上述過程重復(fù)35次。以內(nèi)參β-actin校正，2-△△Ct法計算TGIF2 mRNA相對表達(dá)水平。

1.4Western印跡檢測 向4組細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，提取各組細(xì)胞的總蛋白，并以二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒對其定量。將所提取的總蛋白以沸水浴變性5 min后，取60 μg上樣至10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分離，每組設(shè)置3個復(fù)孔。開始以80 V電泳，至分離膠后改為120 V。待結(jié)束后，以半干法轉(zhuǎn)印。再將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜置于含有5%脫脂奶粉的封閉液中。反應(yīng)2.5 h后，加入1 000倍稀釋的TGIF2抗體和β-actin抗體，4℃下過夜。次日，經(jīng)Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌后，加入2 500倍稀釋的二抗，反應(yīng)1 h。洗膜后，加顯色液電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。以β-actin作內(nèi)參，Image J軟件分析各組HUVECs細(xì)胞中TGIF2蛋白的相對表達(dá)量。

1.5細(xì)胞增殖實驗 取96孔細(xì)胞板，以每孔55 000個細(xì)胞接種，以10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。實驗分組及處理同1.2，每組設(shè)5個平行孔，每組重復(fù)3次。處理完畢后，在孵箱中培養(yǎng)24 h和48 h后，取出培養(yǎng)板。每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml MTT溶液，培養(yǎng)4 h后棄上清，加150 μl二甲基亞砜。待充分反應(yīng)后，以酶標(biāo)儀檢測各組HUVECs細(xì)胞在570 nm處的吸光度(OD)值。

1.6細(xì)胞遷移實驗 以無血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮4組細(xì)胞，制備濃度為50 000個/ml的細(xì)胞懸液。取Transwell小室(孔徑8 μm)，上室中加細(xì)胞懸液200 μl，下室中加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基500 μl。將小室置于孵箱(條件為5%CO2、37℃)中孵育24 h后取出。輕輕擦去上室中細(xì)胞，以4%甲醇固定10 min后，加吉姆薩染色5 min。經(jīng)漂洗液清洗晾干后，置于200倍顯微鏡下觀察。隨機(jī)取5個視野，統(tǒng)計穿膜細(xì)胞數(shù)目，計算平均值。每組實驗重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞凋亡實驗 取4組細(xì)胞，以預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞后，離心棄上清，加入200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，分別加入體積均為5 μl Annexin V/FITC和PI進(jìn)行雙染色。37℃下避光反應(yīng)20 min后，上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。每組實驗重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1高糖誘導(dǎo)下調(diào)TGIF2表達(dá)及轉(zhuǎn)染效果 與對照組相比，高糖組、NC高糖組和TGIF2高糖組HUVECs細(xì)胞中TGIF2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與高糖組相比，NC高糖組細(xì)胞差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而TGIF2高糖組均顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 Western印跡檢測結(jié)果

組別TGIF2mRNATGIF2蛋白對照組101±005054±003高糖組042±0031)020±0021)NC高糖組040±0021)018±0031)TGIF2高糖組073±0061)2)041±0051)2)F/P值135676/000076489/0000

與對照組比較：1)P<0.05；與高糖組比較：2)P<0.05，下表同

2.2上調(diào)TGIF2表達(dá)減弱高糖對HUVECs細(xì)胞增殖的抑制作用 在相同作用時間下，與對照組相比，高糖組、NC組和TGIF2高糖組中HUVECs細(xì)胞活力均明顯降低(P<0.05)；而高糖組和NC高糖組間細(xì)胞活力無顯著變化(P>0.05)，但TGIF2高糖組細(xì)胞活力顯著高于高糖組(P<0.05)。見表2。

表2 各組HUVECs細(xì)胞在570 nm處的OD值

2.3上調(diào)TGIF2表達(dá)減弱高糖對HUVECs細(xì)胞遷移的抑制作用 與對照組穿膜細(xì)胞數(shù)〔(81.0±7.8)個〕比較，高糖組、NC高糖組、TGIF2高糖組〔(52.5±5.0)、(49.2±6.5)、(65.5±4.2)個〕HUVECs細(xì)胞的遷移能力均明顯降低(P<0.05)；而NC高糖組較高糖組無顯著變化(P>0.05)，但TGIF2高糖組較高糖組顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

2.4上調(diào)TGIF2表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡 高糖處理后HUVECs細(xì)胞的凋亡率顯著高于對照組(5.28%±0.35%，P<0.05)；與高糖組(16.45%±2.02%)比較，NC高糖組(15.76%±1.63%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但TGIF2高糖組(10.06%±1.25%)顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

有研究顯示，糖尿病患者發(fā)生心腦血管疾病的概率明顯高于非糖尿病患者〔5〕。糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病患者中最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，高糖是其重要誘因。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損是糖尿病血管病變的重要機(jī)制〔6〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和凋亡與糖尿病血管病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，尋找有效的治療靶點進(jìn)行早期干預(yù)對治療和緩解糖尿病血管并發(fā)癥具有重要意義。

TGIF2可結(jié)合DNA或與Smads相互作用抑制TGFp基因表達(dá)發(fā)揮抑制作用，參與如癌癥、骨質(zhì)疏松等生理病理過程〔7～9〕。Hu等〔10～12〕研究表明，TGIF2是miR-34a基因的靶基因，miR-34a能夠通過下調(diào)TGIF2表達(dá)，調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、減輕激素誘導(dǎo)的股骨頭缺血性壞死和抑制多發(fā)性骨髓瘤腫瘤干細(xì)胞的生長。Shen等〔13〕指出，miR-34a在糖尿病患者外周血中高表達(dá)；同時，Li等〔14〕發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激蛋白p66Shc能夠通過誘導(dǎo)miR-34a產(chǎn)生，導(dǎo)致糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙；另外，TGIF2在糖尿病胰島β細(xì)胞的分化和形成中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用〔4〕。因此推測TGIF2也可能在糖尿病血管內(nèi)皮損傷方面發(fā)揮重要作用。楊亞麗等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，TGIF2在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，沉默其表達(dá)能顯著抑制A172細(xì)胞增殖、遷移能力，并促進(jìn)凋亡。目前，糖尿病血管內(nèi)皮損傷的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制尚不明確，本研究結(jié)果提示，TGIF2可能在糖尿病血管內(nèi)皮損傷過程中發(fā)揮著抑制HUVECs細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上，在高糖作用下，HUVECs細(xì)胞中TGIF2低表達(dá)，在血管內(nèi)皮損傷中發(fā)揮重要作用；上調(diào)TGIF2表達(dá)后，對高糖引起的血管內(nèi)皮損傷有一定的改善作用。

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