雷凱雄 周清平 唐武成 楊 莉

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

肝纖維化是多種慢性疾病發(fā)展為肝硬化的中間病理過(guò)程，是細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡致使其過(guò)渡沉積的結(jié)果；肝星狀細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源，該細(xì)胞的活化和增殖被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素〔1，2〕。肝纖維化是一種機(jī)體的慢性炎癥反應(yīng)，炎癥過(guò)程在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔3，4〕。肝星狀細(xì)胞是肝臟炎癥過(guò)程的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，它的活化過(guò)程受到多種信號(hào)通路和細(xì)胞因子的共同調(diào)控。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB是一種炎癥反應(yīng)最為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟炎癥反應(yīng)活性氧、細(xì)胞因子和炎性因子等的產(chǎn)生和分泌過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔5〕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是介導(dǎo)纖維化最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，在細(xì)胞外基質(zhì)代謝和激活肝星狀細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用〔6，7〕。葛根素是一種在癌癥、糖尿病和心血管疾病等多種疾病中具有很好抗感染作用的常用中藥〔8〕。本研究旨在探討葛根素對(duì)肝星狀細(xì)胞生長(zhǎng)及NF-κB p65、TGF-β1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑和儀器 大鼠肝星狀HSC-T6 細(xì)胞購(gòu)于上海美軒生物科技公司，葛根素購(gòu)于南京狄爾格公司。RPMI1640培養(yǎng)基和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑和Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)Inbitrogen公司，青鏈霉素購(gòu)于杭州吉諾公司，一抗(NF-κB p65抗體和β-actin抗體)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，二抗 〔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔〕購(gòu)于武漢博士德公司，總蛋白提取試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京碧云天公司。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于北京六一儀器廠，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Forma Scientific公司，酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Tek公司。

1.2細(xì)胞處理 將復(fù)蘇后的HSC-T6細(xì)胞種植于含有RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，其中培養(yǎng)基中加有10%胎牛血清和1%青鏈霉素。放置于5%CO237℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d換液一次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶底70%左右時(shí)，開(kāi)始加0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集穩(wěn)定生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSC-T6 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將上述收集的HSC-T6細(xì)胞，以每孔100 μl細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為4.5×106個(gè)/ml)接種至96孔細(xì)胞板中培養(yǎng)，1 d后更換培養(yǎng)基。將HSC-T6細(xì)胞隨機(jī)分別溶劑組和葛根素組，其中，葛根素組包括0.1、1.0和10.0 μmol/L 3個(gè)不同濃度組，溶劑組中加入等量濃度為0.1% DMSO的培養(yǎng)基，每組設(shè)4個(gè)平行孔，重復(fù)3次，分別于培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)24、48和72 h。配制至所需時(shí)間后，加入20 μl MTT溶液，待反應(yīng)4 h后，以酶標(biāo)儀檢測(cè)各組的吸光度OD值(檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm)。

1.4細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 取6孔細(xì)胞板，以每孔100 μl細(xì)胞濃度為5.0×106個(gè)/ml的懸液進(jìn)行接種，在常規(guī)條件5%CO2和37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。根據(jù)1.3中的分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、離心后，收集細(xì)胞，加500 μl預(yù)冷的70%乙醇，在4℃環(huán)境下反應(yīng)4 h，離心棄上清，加RNase A 100 μl常溫反應(yīng)30 min。再加碘化丙啶400 μl于4℃下避光反應(yīng)30 min。于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組HSC-T6細(xì)胞的周期分布情況。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞中TGF-β1的含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，按照每孔100 μl(細(xì)胞濃度同上)接種到96孔板中，與細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜后，以葛根素按1.3中的分組處理細(xì)胞，再培養(yǎng)72 h后，離心收取上清液，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)各組HSC-T6細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)情況。

1.6Western印跡檢測(cè)NF-κB p65蛋白的表達(dá) 將葛根素處理72 h后的HSC-T6細(xì)胞，以PBS洗滌后，加預(yù)冷的RIPA裂解液提取總蛋白，并以BCA法進(jìn)行定量。取總蛋白樣品60 μg和5倍上樣緩沖液5 μl混合，置于沸水浴中變性10 min。在SDS-PAGE凝膠中上樣變性蛋白，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。以封閉液(含5%脫脂奶的粉TBST)作用2 h后，加NF-κB p65(1∶500稀釋)和β-actin(1∶1 000稀釋)一抗4℃下孵育24 h。TBST洗膜后，加1∶5 000倍稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，常溫孵育2 h。洗膜后，加ECL顯色定影。采用Band Scan軟件分析條帶，以β-actin作內(nèi)參，計(jì)算各組HSC-T6細(xì)胞中NF-κB p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、One-way ANOVA和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1葛根素對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響 MTT分析顯示，與溶劑組相比，不同濃度葛根素均能抑制HSC-T6細(xì)胞增殖(P<0.05)，且表現(xiàn)出一定的濃度-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。在72 h時(shí)10.0 μmol/L葛根素處理下，HSC-T6 細(xì)胞OD值下降幅度最大。因此，選用72 h作用時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 各組HSC-T6 細(xì)胞的OD值

與溶劑組比較：1)P<0.05；下表同

2.2葛根素對(duì)HSC-T6 細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)葛根素處理后的HSC-T6 細(xì)胞的周期分布明顯發(fā)生了改變，細(xì)胞被阻滯于G0/G1期。與溶劑組比較，葛根素處理組中細(xì)胞在G0/G1期所占比例明顯升高(P<0.05)，而S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)，且隨葛根素濃度的增加，變化越顯著。見(jiàn)表2。

表2 各組HSC-T6 細(xì)胞的周期分布

2.3葛根素對(duì)HSC-T6細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)及NF-κB p65蛋白的影響 與溶劑組相比葛根素處理組中TGF-β1含量隨葛根素濃度的增加而呈下降趨勢(shì)，NF-κB p65蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，且表現(xiàn)出一定的葛根素濃度效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖1。

表3 葛根素對(duì)各組HSC-T6 細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)

圖1 Western印跡檢測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討 論

肝纖維化的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，肝星狀細(xì)胞的異常增殖與活化是肝纖維化發(fā)生和形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此抑制肝星狀細(xì)胞的生長(zhǎng)是治療和改善肝纖維化的重要機(jī)制。葛根素是一種從中藥葛根中提取的異黃酮類化合物，對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程具有很好的抑制作用。在低氧環(huán)境下，葛根素對(duì)缺氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，進(jìn)而對(duì)改善和治療缺氧性肺動(dòng)脈高壓有良好的效果〔9〕；在血管平滑肌細(xì)胞中，葛根素通過(guò)上調(diào)p27蛋白和下調(diào)細(xì)胞周期蛋白(cyclin)E表達(dá)使G0/G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞數(shù)減少，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖〔10〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠呈濃度-時(shí)間依賴性抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，與郝原青等〔11〕結(jié)果相吻合。本研究結(jié)果提示，葛根素具有很好的抗肝纖維化作用，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。

葛根素具有抗腫瘤、抗氧化和抗感染等多種生理作用，而其抗感染作用正逐漸受到關(guān)注和重視；它能夠通過(guò)調(diào)控炎性因子、免疫細(xì)胞和信號(hào)通路等多種方式發(fā)揮抗感染作用，從而改善癌癥、心血管疾病和糖尿病等炎癥相關(guān)疾病的病理過(guò)程〔8，12〕。潘亮亮等〔13〕指出，在Lewis肺癌荷瘤小鼠中，葛根素可能通過(guò)增加腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-2含量和抑制腫瘤組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表達(dá)，抑制小鼠Lewis肺癌原發(fā)瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Liu等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血/再灌注大鼠模型中，葛根素能夠降低缺血梗死體積，降低腦組織中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)，從而改善神經(jīng)功能。Pan等〔15〕在葛根素減輕糖尿病大鼠腎損傷的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，其作用機(jī)制可能與葛根素下調(diào)TNF-α和細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1的水平有關(guān)。同時(shí)，胡麗梅等〔16〕還發(fā)現(xiàn)，在妊娠糖尿病患者中，葛根素能夠抑制炎癥信號(hào)通路TLR4/NF-κB的活化而減少炎性因子的釋放。炎癥反應(yīng)與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔17〕，肝細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子、炎性因子和生長(zhǎng)因子等是激活肝星狀細(xì)胞的重要機(jī)制之一。NF-κB是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，TGF-β1是最為強(qiáng)效的致纖維化細(xì)胞因子，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。Ji等〔18〕指出，葛根素能夠通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路抑制動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)。Tao〔19〕發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠抑制心肌梗死小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1的活化，降低心肌組織中TGF-β1的表達(dá)，從而減輕小鼠的心肌纖維化。本研究結(jié)果提示，葛根素可能通過(guò)抑制炎癥相關(guān)因子TGF-β1和NF-κB信號(hào)通路，緩解肝纖維化過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而起到抑制HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

綜上，葛根素能夠抑制肝星狀細(xì)胞生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥相關(guān)因子TGF-β1和NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

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