尚立芝 吳 珂 謝文英 趙曉云 郜新蓮 張 淼 梁娟娟 王 祎 亓照耀 徐莉莉

(河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

隨著大氣污染和老齡化日益加重，慢性支氣管炎的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率呈劇增趨勢(shì)〔1〕。本課題組經(jīng)臨床觀察和前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，基于二陳湯的愛羅咳喘寧能明顯改善慢性支氣管炎患者和動(dòng)物模型的咳、痰、喘等癥狀，但二陳湯治療慢性支氣管炎的作用及其機(jī)制不明〔2～7〕。本研究采用香煙煙霧加內(nèi)毒素制備慢性支氣管炎大鼠模型，觀察二陳湯原方對(duì)大鼠支氣管組織中與氣道黏液分泌有關(guān)的黏蛋白(MUC)5AC、水通道蛋白(AQP)5蛋白表達(dá)的影響，探討二陳湯對(duì)慢性支氣管炎氣道黏液分泌的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物、主要試劑與儀器 二陳湯方藥物組成：姜半夏10 g(批號(hào)1309001H)、茯苓16 g(批號(hào)1309001H)、陳皮10 g(批號(hào)1302001H)、甘草6 g(批號(hào)1302001S)等為三九醫(yī)藥生產(chǎn)中藥配方顆粒。脂多糖(L8880，701c034，Solarbio公司)，MUC5AC兔抗大鼠一抗試劑盒(bs-7166R)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，AQP5兔抗大鼠一抗試劑盒(BA2205)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。LEICA RM 2265全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、LEICA EM UC7超薄切片機(jī)、HI1210攤片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)，OLYMPUS顯微攝像儀及圖像采集系統(tǒng)(JAPAN 20486，TOKYO)，Motic數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)等。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供7～8月齡SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，體重(250±20)g，合格證號(hào)SCXK魯20130001。隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、二陳湯高、中、低劑量組組，急支糖漿組，每組10只。正常組和急支糖漿組無(wú)死亡，大鼠一般狀況好，體重增加。模型組死亡2只，存活鼠體重下降。二陳湯高、中、低劑量組各死亡1只，存活大鼠體重稍增。

1.3制備模型 正常組不熏煙，第1和第14日經(jīng)氣管注入生理鹽水200 μl。參照文獻(xiàn)及前期研究〔8，9〕，采用熏香煙煙霧加氣管注內(nèi)毒素脂多糖制備慢支大鼠模型。實(shí)驗(yàn)第1、第14日，注入氣管內(nèi)200 μl內(nèi)毒素脂多糖(1 mg/ml)。第2～13日，第15～28日將大鼠置于箱內(nèi)熏香煙煙霧，香煙8支/次，30 min/次，2次/d。

1.4給藥 依據(jù)肺功能檢測(cè)和組織病理結(jié)果判斷模型是否成功，模型制備成功后。參考文獻(xiàn)〔10～12〕，急支糖漿組灌胃太極急支糖漿12 g/kg，二陳湯高、中、低劑量組9.80、4.90、2.45 g/kg，灌胃，稀釋成6 ml，2次/d，3 ml/次。正常組及模型組生理鹽水6 ml/d灌胃，連續(xù)14 d。

1.5標(biāo)本制備 取氣管、支氣管組織，甲醛溶液固定、石蠟包埋，5 μm厚切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察氣管、支氣管組織結(jié)構(gòu)。

1.6MUC5AC和AQP5蛋白的原位表達(dá)及結(jié)果判斷〔13〕免疫組化(IHC，S-P)檢測(cè)主要步驟按試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行。①切片脫蠟至水；②3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；③羊血清封閉；④加第一抗工作液(1∶100)4℃孵育過(guò)夜；⑤加生物素化二抗工作液；⑥二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后蘇木素復(fù)染。以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作空白對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。以棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，不著色為陰性。用Olympus GX51全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選取400倍10個(gè)視野，分析陽(yáng)性染色吸光度(A)的平均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.5軟件進(jìn)行方差分析及Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

在正常組、模型組細(xì)支氣管MUCSAC均有表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)為胞質(zhì)、胞膜的呈棕黃色，以胞質(zhì)為主。與正常組比較，模型組MUC5AC蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)；與模型組相比，二陳湯高、中劑量組MUC5AC蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.01)。在正常組、模型組細(xì)支氣管AQP5有陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性信號(hào)為胞質(zhì)棕黃色顆粒為主，細(xì)胞膜也有陽(yáng)性；與正常組比較，模型組AQP5蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，二陳湯高、中劑量組AQP5蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)(均P<0.01)，見表1，圖1，圖2。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，在正常組AQP5蛋白與MUC5AC蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.650,P<0.05)。在模型組(rs=-0.883,P<0.01)和二陳湯中劑量組(rs=-0.795,P<0.01)AQP5蛋白與MUC5AC蛋白表達(dá)呈非常顯著負(fù)相關(guān)。而在二陳湯高(rs=-0.631,P>0.05)和低劑量組(rs=-0.583,P>0.05)AQP5蛋白與MUC5AC蛋白表達(dá)有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但相關(guān)性不顯著。

表1 各組支氣管組織中MUC5AC和AQP5蛋白的表達(dá)

與模型組比較：1)P<0.01

圖1 各組細(xì)支氣管組織MUC5AC蛋白表達(dá)(DAB，×100)

圖2 各組細(xì)支氣管組織AQP5蛋白表達(dá)(DAB，×100)

3 討 論

慢性支氣管炎與感染、過(guò)敏、寒冷、吸煙、空氣污染及患者內(nèi)在因素有關(guān)。上述病因刺激可直接或通過(guò)神經(jīng)-內(nèi)分泌引起支氣管黏液腺分泌亢進(jìn)，炎癥反復(fù)刺激使呼吸道黏膜假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮損傷，黏液腺肥大、增生。脫落的黏膜、炎性滲出物與黏液混合形成黏液栓，是慢性支氣管炎臨床咳、痰、喘的病理基礎(chǔ)。慢性支氣管炎最初表現(xiàn)為間歇性咳嗽、咳痰，中醫(yī)診斷為“咳嗽”；繼之肺失宣降，久病肺虛伴喘，中醫(yī)又診斷為“喘證”；慢性支氣管炎反復(fù)遷延可并發(fā)肺動(dòng)脈高壓、肺源性心臟病，出現(xiàn)以心慌、水腫、口唇發(fā)紺等心衰表征時(shí)，屬于中醫(yī)的“肺脹”范疇。二陳湯由半夏、陳皮、茯苓、甘草組成。方中半夏燥濕化痰，主治脾濕痰壅之痰多咳喘氣逆；陳皮燥濕化痰，理氣健脾、和胃止嘔；茯苓健脾滲濕，寧心安神；甘草補(bǔ)脾益氣、潤(rùn)肺止咳。諸藥合用共奏燥濕和中，理氣化痰之功。

基于假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮-黏液共同構(gòu)成纖毛-黏液排送系統(tǒng)。氣道中吸入的粉塵、病原體可被黏液黏附，靠纖毛自下而上擺動(dòng)，將黏液以痰的形式咳出體外，故黏液是凈化氣道的重要組成部分。慢性支氣管炎患者表現(xiàn)咳嗽、咳痰，痰量多，而且黏稠，不易咳出。其機(jī)制是由于黏液分泌過(guò)多，纖毛因負(fù)荷過(guò)重而發(fā)生粘連、倒伏、甚至脫落。氣道黏液中95%以上是水，其余為離子、蛋白和糖蛋白等〔14〕，黏液中的水與黏蛋白比例失衡，尤其黏液中的高黏蛋白含量增加，使痰液黏稠形成黏液栓，難以咳出，導(dǎo)致氣流受限。AQP5是主要的水轉(zhuǎn)運(yùn)通道，黏液下腺AQP5的減少可以導(dǎo)致氣道水分含量的減少和黏蛋白濃度增加〔15〕。本研究顯示，AQP5表達(dá)降低引起的黏液中的水分泌下降。作為衡量氣道上皮黏液分泌指標(biāo)的MUCSAC在慢性支氣管炎模型組表達(dá)增加，導(dǎo)致氣道黏蛋白分泌增加，使痰變得黏稠不易咳出，從而繼發(fā)感染，加重病情。Towne等〔16,17〕研究發(fā)現(xiàn)，用TNF-α干預(yù)培養(yǎng)小鼠肺上皮細(xì)胞后AQP5蛋白表達(dá)下降，腫瘤壞死因子(TNF)-α可以誘導(dǎo)大鼠氣管上皮細(xì)胞MUCSAC蛋白的高表達(dá)。本文提示二陳湯可能通過(guò)上調(diào)AQP5表達(dá)的同時(shí)，下調(diào)黏蛋白MUCSAC的表達(dá)，影響氣道黏液中水分與黏蛋白的比例，從而發(fā)揮其利痰清肺的作用。

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