王建華 王偉偉 王衛(wèi)國

(阜陽市人民醫(yī)院檢驗科，安徽 阜陽 236000)

胃癌患者發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已處于中晚期，研究對胃癌轉移、侵襲影響的機制對于早期發(fā)現(xiàn)及靶向治療具有重要意義〔1〕。Six1是同源異形盒(Hox)基因家族的成員，在多種生物中均有表達，且參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔2〕。有研究顯示，在宮頸癌、肺癌等多種腫瘤中Six1呈高表達，其高表達不僅能導致細胞發(fā)生惡性增生，且參與腫瘤的轉移和侵襲過程，但調控的具體機制目前尚未完全明確〔3,4〕。有研究顯示，胃癌中Six1表達明顯增高，其表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期等明顯相關，可能是胃癌預后評估的一個獨立生物標志物〔5〕；沉默胃癌中Six1的表達可降低細胞的克隆形成數(shù)、誘導細胞凋亡及增加對5-氟尿嘧啶化療的敏感性〔6〕。但Six1對胃癌細胞侵襲及B7-H1表達的影響尚未清楚。本研究通過RNA干擾技術沉默胃癌細胞Six1的表達，旨在探討Six1對癌細胞增殖侵襲、B7-H1表達的影響。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑和儀器 人正常胃黏膜上皮細胞GES-1及胃癌MKN45、AGS和BGC823細胞均購自中國科學院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、MTT試劑均購自美國Gibco；Bradford蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物；Transwell小室購自美國Coming Costar；Six1、B7-H1、p-JAK2、p-STAT3、細胞周期蛋白(cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體均購自美國Abcam；酶標儀購自美國Bbio-TEK；流式細胞儀購自美國BD。

1.2細胞培養(yǎng) GES-1、MKN45和BGC823細胞采用DMEM培養(yǎng)基，AGS細胞用F12K培養(yǎng)基，于5%體積分數(shù)的CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，隔天換液，細胞生長達85%左右融合時，胰酶消化后傳代。實驗選擇生長至對數(shù)期的細胞。

1.3細胞轉染 轉染前1 d以1×106/ml接種生長至對數(shù)期的BGC823細胞(2 ml無抗生素培養(yǎng)液)于6孔板，以便次日轉染時細胞生長融合可達60%～80%。轉染參照脂質體LipofectamineTM2000轉染說明進行操作，分別轉染NC組(非特異性siRNA)和si-Six1(轉染Six1特異性的siRNA的干擾組)，并設置僅加入脂質體的為空白對照組，轉染后于5%體積分數(shù)的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6 h，換為含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實驗研究。

1.4Western印跡檢測蛋白表達 胰酶消化離心生長至對數(shù)期的GES-1、MKN45、AGS和BGC823細胞及按照1.3分組轉染48 h的細胞，加入細胞裂解液，反復吹打以使細胞能夠充分裂解，裂解完全后離心，收集上清(上清為提取的蛋白)，Bradford法對蛋白進行定量，取上清液50 μg與2倍十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液按照4∶1比例充分混勻，100℃煮沸變性，每孔道上樣40 μg變性蛋白，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)(10%)后，電轉移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉轉好的PVDF膜1 h，4℃搖床孵育已稀釋好的Six1、B7-H1、p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1、MMP-2和內(nèi)參GAPDH抗體(按照1∶500～1 000稀釋)過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育2 h，ECL化學發(fā)光顯影。凝膠自動分析軟件進行分析。以Six1、B7-H1、p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1、MMP-2與內(nèi)參GAPDH的吸光度比值作為各蛋白的相對表達量。

1.5MMT法測定各組細胞活力 每孔5×103個細胞接種生長至對數(shù)期的BGC823細胞于96孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后參照1.3分組轉染，于轉染的48 h在每孔中加入MTT液(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，除去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫搖床混勻15 min，酶標儀測定各孔吸光度值(OD值，490 nm)。實驗重復3次。

1.6Transwell小室測定各組細胞侵襲能力 4℃冰箱解凍Matrigel膠，與無血清的DMEM培養(yǎng)液按照1∶8比例混合均勻，每孔加入80 μl鋪在24孔Transwell小室上室，于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)3 h，收集按照1.3分組轉染48 h的各組細胞，胰酶消化后制備成單細胞懸液，每孔5×103個接種在上室，放置上室于24孔板中，加入無血清的培養(yǎng)液250 μl在上室中，下室中加入含血清的培養(yǎng)液750 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽輕輕擦掉上室底部基質膠及未侵襲的細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后甲醇固定30 min，結晶紫染色20 min，室溫風干，隨機選擇5個視野，顯微鏡下計數(shù)，求均值。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1胃癌細胞中Six1的表達 胃癌MKN45、BGC823和AGS細胞中Six1的蛋白表達(0.237±0.026，0.555±0.049，0.387±0.041)均顯著高于在GES-1細胞中的表達(0.102±0.011，P<0.05)，見圖1。

圖1 胃癌細胞中Six1的表達

2.2si-Six1轉染抑制BGC823細胞活力及侵襲能力 MTT及Transwell小室檢測結果顯示，與NC組比較，si-Six1組細胞活力及侵襲能力均顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 si-Six1轉染抑制BGC823細胞活力及侵襲能力

與NC組比較：1)P<0.05；下表同

2.3si-Six1轉染BGC823細胞效果 si-Six1轉染BGC823細胞48 h，si-Six1組Six1的表達(0.091±0.010)顯著低于空白對照組(0.342±0.035，P<0.05)，而NC組(0.334±0.032)與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 si-Six1轉染BGC823細胞后各組細胞Six1的蛋白表達

2.4si-Six1轉染降低BGC823細胞B7-H1蛋白表達 Western印跡檢測顯示，與NC組(0.508±0.051)比較，si-Six1組B7-H1蛋白表達(0.108±0.011)顯著降低(P<0.05)，空白對照組(0.529±0.056)與NC組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 si-Six1轉染對BGC823細胞B7-H1蛋白表達的影響

2.5si-Six1轉染下調BGC823細胞JAK2/STAT3信號 Western印跡檢測結果顯示，與NC組比較，si-Six1組p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1和MMP-2的蛋白表達均顯著降低(均P<0.05)，見圖4，表2。

圖4 si-Six1轉染對BGC823細胞p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1、MMP-2蛋白表達的影響

組別p?JAK2p?STAT3cyclinD1MMP?2空白對照組0111±00100173±00200452±00480257±0026NC組0121±00130157±00180471±00500280±0028si?Six1組0047±00071)0038±00061)0146±00181)0141±00151)

3 討 論

Hox是在進化高度保守的一類DNA序列，Six1是新近發(fā)現(xiàn)的Hox家族成員，Six1在Six家族中研究最多，有研究顯示，Six1蛋白是多種器官發(fā)育所必需的，可維持細胞生存，細胞周期及抑制細胞凋亡〔7,8〕。多種腫瘤中Six1出現(xiàn)過表達，可促進細胞增殖、分化，活化細胞周期，但其作用機制尚未清楚。但也有研究指出，抑制腫瘤中Six1的表達可降低其發(fā)生發(fā)展〔9〕。如宮頸癌中上調Six1表達可加快癌細胞增殖，增加細胞侵襲能力，縮短細胞周期，而下調Six1表達后細胞增殖及侵襲能力均顯著降低，且阻滯細胞在G2/M期〔10〕；肺癌中下調Six1表達后癌細胞的增殖及遷移能力均明顯降低〔11〕。

RNA干擾是沉默基因表達的一種方法，由于其可有效抑制分裂期和非分裂期細胞，且具有特異性、高效性等優(yōu)勢，已廣泛應用于基因治療和基因功能研究等方面〔12，13〕。本研究結果顯示，RNA干擾Six1后BGC823細胞中Six1的表達明顯降低，且可有效降低細胞的活力及侵襲能力，提示抑制Six1表達可降低胃癌的發(fā)生發(fā)展。B7-H1是B7家族中的一員，是一種重要的負性協(xié)同刺激分子，可介導腫瘤發(fā)生免疫逃逸〔14〕。有研究顯示，胃癌中B7-H1的表達升高，與TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度等有關，可能是判斷胃癌預后的一個新指標〔15〕。在卵巢癌細胞與巨噬細胞非接觸共培養(yǎng)后，可發(fā)現(xiàn)兩種細胞B7-H1表達均比非培養(yǎng)組有明顯增高，而抑制JAK2/STAT3等信號通路后B7-H1的表達受到抑制〔16〕。這提示抑制JAK2/STAT3信號可能影響B(tài)7-H1的表達。JAK2/STAT3的活化與胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的惡化有關〔17.18〕，有研究顯示，阻斷肝癌JAK2/STAT3信號可降低癌細胞增殖，且下調下游分子survivin〔19〕，抑制胃癌中JAK2/STAT3信號可降低腫瘤細胞侵襲能力，且下調下游分子MMP-2和MMP-9的表達〔20〕。本研究結果提示Six1可通過下調JAK2/STAT3信號影響胃癌的增殖、侵襲及免疫。

綜上，下調胃癌細胞Six1表達可降低癌細胞活力及侵襲能力，降低B7-H1表達，機制可能是抑制JAK2/STAT3信號通路。Six1可能是胃癌分子診療的一個新的靶點，值得進一步深入的研究。

1Liang X,Shi H,Yang L,etal.Inhibition of polypyrimidine tract-binding protein 3 induces apoptosis and cell cycle arrest and enhances the cytotoxicity of 5-fluorouracil in gastric cancer cells〔J〕.Br J Cancer,2017;116(7):903-11.

2Tian T,Li A,Lu H,etal.Six1 promotes glioblastoma cell proliferation and invasion by upregulation of connective tissue growth factor〔J〕.Am J Cancer Res,2015;5(5):1823-30.

3Sun SH,Liu D,Deng YT,etal.SIX1 coordinates with TGFβ signals to induce epithelial-mesenchymal transition in cervical cancer〔J〕.Oncol Lett,2016;12(2):1271-8.

4曹燕飛,任 睿,楊 曄,等.miR-185靶向Six1對肺癌上皮-間質轉化過程的影響及其機制〔J〕.臨床與實驗病理學雜志,2017;33(8):879-83.

5Lv H,Cui A,Sun F,etal.Sineoculis homeobox homolog 1 protein as an independent biomarker for gastric adenocarcinoma〔J〕.Exp Mol Pathol,2014;97(1):74-80.

6Du P,Jing Z,Jing W,etal.Sine oculis homeobox homolog 1 regulates mitochondrial apoptosis pathway via caspase-7 in gastric cancer cells〔J〕.J Cancer,2017;8(4):636-45.

7Li ZM,Tian T,Hu XP,etal.Targeting Six1 by lentivirus-mediated RNA interference inhibits colorectal cancer cell growth and invasion〔J〕.Inter J Clin Exp Pathol,2014;7(2):631-9.

8Zeng J,Min W,Rong S,etal.MiR-204-5p/Six1 feedback loop promotes epithelial-mesenchymal transition in breast cancer〔J〕.Tumor Biol,2016;37(2):2729-35.

9Wu W,Ren Z,Li P,etal.Six1:A critical transcription factor in tumorigenesis〔J〕.Inter J Cancer,2015;136(6):1245-53.

10鄭秀惠.Six1基因對宮頸癌細胞生物學行為的影響及其機制研究〔D〕.重慶：第三軍醫(yī)大學,2010.

11Xia Y,Zhu Y,Ma T,etal.miR-204 functions as a tumor suppressor by regulating SIX1 in NSCLC〔J〕.Febs Lett,2014;588(20):3703-12.

12孫 靜,任麗莉,張曉玉,等.支架蛋白 RACK1 小干擾 RNA 抑制卵巢癌細胞 CAOV3 的增殖、遷移和侵襲〔J〕.中國老年學雜志,2017;37(2):263-6.

13Fitzgerald K,Frank-Kamenetsky M,Shulga-Morskaya S,etal.Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(PCSK9)and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers:a randomised single-blind placebo-controlled phase 1 trial〔J〕.Lancet,2014;383(9911):60-8.

14Cimino-Mathews A,Thompson E,Taube JM,etal.PD-L1(B7-H1)expression and the immune tumor microenvironment in primary and metastatic breast carcinomas〔J〕.Human Pathol,2016;47(1):52-63.

15Xie G,Li W,Li R,etal.Helicobacter pylori promote B7-H1 expression by suppressing miR-152 and miR-200b in gastric cancer cells〔J〕.PLoS One,2017;12(1):e0168822.

16熊海玉,馬婷婷,王 秦,等.卵巢癌細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)對B7-H1表達的影響及機制〔J〕.中國細胞生物學學報,2013;(12):1760-4.

17Judd LM,Menheniott TR,Ling H,etal.Inhibition of the JAK2/STAT3 pathway reduces gastric cancer growth in vitro and in vivo〔J〕.PLoS One,2014;9(5):e95993.

18Rodriguez-Barrueco R,Yu J,Saucedo-Cuevas LP,etal.Inhibition of the autocrine IL-6-JAK2-STAT3-calprotectin axis as targeted therapy for HR-/HER2+ breast cancers〔J〕.Genes Dev,2015;29(15):1631-48.

19Lei RE,Shi C,Zhang PL,etal.IL-9 promotes proliferation and metastasis of hepatocellular cancer cells by activating JAK2/STAT3 pathway〔J〕.Inter J Clin Exper Pathol,2017;10(7):7940-6.

20Ouyang J,Pan X,Lin H,etal.GKN2 increases apoptosis reduces the proliferation and invasion ability of gastric cancer cells through down-regulating the JAK/STAT signaling pathway〔J〕.Am J Translat Res,2017;9(2):803-11.