金 強 姚曉玲 胡恩赑

(蚌埠市第三人民醫(yī)院檢驗科，安徽 蚌埠 233000)

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是包含錯配修復(fù)基因突變、抑癌基因缺失或失活及癌基因激活等多階段、多基因的一個復(fù)雜過程，闡明結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制具有重要意義〔1〕。目前，多項研究顯示腫瘤與脂質(zhì)體代謝紊亂存在相關(guān)性，5-脂氧合酶(LOX)是花生四烯酸代謝的一個關(guān)鍵酶，在正常組織中低表達或不表達，而在前列腺癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤中過度表達，其過度表達可加速腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞分化和凋亡，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔2～4〕。有研究顯示，結(jié)直腸癌中5-LOX表達上調(diào)，且表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤深度和TNM分期有關(guān)〔5〕，5-LOX抑制劑可抑制癌細胞生長。RNA干擾是一種能使轉(zhuǎn)錄后的基因發(fā)生沉默的方法，具有高度的有效性、特異性，已成為研究基因功能有效的工具〔6〕。因此，本研究旨在觀察抑制5-LOX表達后對人結(jié)直腸癌HCT116細胞活力、凋亡的影響及可能分子機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen；DCFH-DA熒光試劑購自美國Sigma；Bradford試劑盒、電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒均購自碧云天生物；酶標(biāo)儀及Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒均購自美國Thermo；CCK8試劑購自日本Tonjindo公司；5-LOX、p-IκBα、cyclinD1、Bcl-2抗體均購自美國Abcam；流式細胞儀購自美國Biorad。

1.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人結(jié)直腸癌HCT116細胞購自中科院上海細胞庫；HCT116細胞復(fù)蘇后用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10%小牛血清)常規(guī)培養(yǎng)和傳代。實驗選擇生長至對數(shù)期的細胞。參照LipofectamineTM2000產(chǎn)品說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d以每孔2.5×105個細胞接種于6孔板，每孔1 ml，共設(shè)置三組，分別為對照組(僅加入脂質(zhì)體)、陰性對照組(NC組，無意義的siRNA系列)和si-5-LOX組(5-LOX的特異性siRNA干擾序列)，均委托廣州銳博生物設(shè)計并合成，細胞達60%～75%生長融合時，換為不含血清和抗生素的培養(yǎng)液，參照轉(zhuǎn)染說明進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～6 h，換為含血清和無抗生素培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗研究。

1.3蛋白質(zhì)印跡 適量的RIPA裂解液提取轉(zhuǎn)染si-5-LOX后48 h的各組HCT116細胞的總蛋白，Bradford試劑盒對蛋白濃度進行檢測，蛋白樣品與適量上樣緩沖液混勻后100℃變性5 min，每孔中上樣40 μg變性蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電冰(SDS-PAGE)，蛋白分離后通過電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂奶粉于室溫條件下封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜1 h，洗膜，4℃搖床孵育5-LOX、p-IκBα、cyclinD1、Bcl-2和內(nèi)參GAPDH抗體(皆按照1∶1 000稀釋)過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫條件孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光劑顯影，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.4CCK8檢測細胞活力 以每孔100 μl(約4×103個細胞)接種生長至對數(shù)期的HCT116細胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后參照1.2方法轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置5個平行孔，于轉(zhuǎn)染的24、48和72 h通過CCK8法檢測細胞活力，檢測前在每孔中加入CCK8試劑10 μl，培養(yǎng)箱孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度值(OD值)，以O(shè)D值反映細胞活力，可以間接反映出細胞的增殖能力。實驗重復(fù)3次。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法進行熒光染色。預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌轉(zhuǎn)染48 h的三組細胞，胰酶消化后重懸細胞于500 μl的Binding緩沖液，流式細胞儀檢測凋亡情況。具體操作參照細胞凋亡試劑盒。實驗重復(fù)3次。

1.6流式細胞儀檢測活性氧(ROS)含量 PBS洗滌轉(zhuǎn)染48 h的細胞，將細胞懸浮于含有DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)的無血清培養(yǎng)液中，避光、37℃培養(yǎng)箱孵育20 min，每間隔3～5 min顛倒一下，以保證細胞和探針能夠接觸充分，孵育完畢，使用培養(yǎng)基(不含血清)洗滌細胞3次，以除去沒有進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，通過流式細胞儀在488 nm的激發(fā)波長和525 nm的最大發(fā)射波長檢測。由于檢測的熒光強度與細胞內(nèi)的ROS水平表現(xiàn)出正相關(guān)，因此可用熒光強度大小反映細胞內(nèi)的ROS水平。實驗重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件，計量資料多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染5-LOX siRNA的HCT116細胞中5-LOX的表達 NC組5-LOX的蛋白表達(0.324±0.036)與對照組(0.311±0.034)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而si-5-LOX組5-LOX的蛋白表達(0.131±0.015)顯著低于對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染5-LOX siRNA的HCT116細胞中5-LOX的表達

2.2沉默5-LOX的表達降低HCT116細胞活力 與NC組比較，si-5-LOX組在24、48、72 h的細胞活力均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 沉默5-LOX的表達對HCT116細胞活力的影響值，n=3)

與NC組比較：1)P<0.05；下表同

2.3沉默5-LOX表達誘導(dǎo)HCT116細胞凋亡 與NC組〔(2.36±0.45)%〕比較，si-5-LOX組細胞凋亡率〔(15.18±1.11)%〕顯著升高(P<0.05)，對照組細胞凋亡率〔(2.24±0.41)%〕與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4沉默5-LOX的表達降低HCT116細胞ROS含量 與NC組(17.3±1.6)比較，si-5-LOX組的ROS含量(32.7±3.2)顯著升高(P<0.05),對照組ROS含量(16.6±1.1)與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5沉默5-LOX的表達下調(diào)NF-κB信號通路 與NC組比較，si-5-LOX組p-IκBα的蛋白表達顯著升高(P<0.05)，cyclinD1和Bcl-2的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 沉默5-LOX表達對NF-κB信號通路的影響

組別p?IκBαcyclinD1Bcl?2對照組0093±00130333±00340261±0026NC組0096±00120348±00360254±0024si?5?LOX組0194±00221)0164±00201)0137±00161)

3 討 論

腫瘤細胞的增殖過快和凋亡減少是降低癌癥患者生存率的一個主要原因，因此降低腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡可有效降低癌癥患者的死亡率。近些年的研究顯示，腫瘤細胞中5-LOX的促增殖和抑凋亡作用是引起腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要環(huán)節(jié)。目前已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中5-LOX出現(xiàn)過表達，其表達可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔7，8〕。有研究顯示，通過RNA干擾技術(shù)抑制胰腺癌5-LOX表達可降低細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡〔9〕；抑制肝癌5-LOX表達可降低肝癌移植瘤的生長〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細胞中5-LOX表達明顯降低，且轉(zhuǎn)染5-LOX的siRNA后的結(jié)直腸癌細胞活力明顯降低，細胞凋亡率顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)5-LOX抑制劑可抑制腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的增殖和誘導(dǎo)凋亡〔11〕。因此，本研究提示采用RNA干擾技術(shù)抑制5-LOX表達同樣可能達到治療結(jié)直腸癌的目的。

有研究證實，細胞內(nèi)因氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS可能會作用于信號分子，對細胞的增殖、凋亡、分化、自噬等生命活動進行調(diào)控，細胞內(nèi)大量的ROS積聚可引起細胞凋亡〔12，13〕。LOX是人體內(nèi)活性氧產(chǎn)生的一個來源，其代謝產(chǎn)物既可以通過引起NADPH氧化產(chǎn)生ROS，也可以作為ROS而發(fā)揮直接的效應(yīng)〔14〕。有研究顯示，5-LOX抑制劑可降低細胞內(nèi)的ROS水平〔15〕。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與腫瘤、免疫、炎癥等的發(fā)生發(fā)展；靜息狀態(tài)下，NF-κB可與抑制因子IκBɑ結(jié)合而在細胞質(zhì)中滯留，當(dāng)細胞被應(yīng)激狀態(tài)或外界刺激影響時，會將相應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路啟動，使IKK激活，引起IκBɑ發(fā)生磷酸化，并使其降解，從而將NF-κB釋放入核而行使轉(zhuǎn)錄因子功能，誘導(dǎo)cyclinD1、Bcl-2等靶基因的表達〔16，17〕。cyclinD1與細胞增殖有密切相關(guān)，Bcl-2是Bcl-2家族一員，發(fā)揮抑凋亡作用，多項研究顯示結(jié)直腸癌中NF-κB信號被激活，可引起cyclinD1和Bcl-2表達升高〔18〕。也有研究發(fā)現(xiàn)，5-LOX抑制劑可通過下調(diào)Bcl-2和cyclinD1等途徑抑制多種腫瘤的生長〔19，20〕。本研究的結(jié)果顯示，抑制結(jié)直腸癌細胞中5-LOX表達后，細胞內(nèi)的ROS含量明顯升高，磷酸化的IκBɑ表達升高，Bcl-2和cyclinD1表達降低。提示5-LOX對結(jié)直腸癌細胞增殖凋亡的影響可能是通過提高細胞內(nèi)ROS含量及下調(diào)NF-κB信號實現(xiàn)的。

綜上所述，抑制結(jié)直腸癌細胞5-LOX的表達可降低細胞活力及誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與降低細胞內(nèi)ROS含量和下調(diào)NF-κB信號通路有關(guān)。本研究提示通過RNA干擾技術(shù)抑制結(jié)直腸癌中高表達的5-LOX可能是其防治的一種方法，但本研究的內(nèi)容有限，因此還需更多的理論進行證實。

1Wiegering A，Matthes N，Mühling B，etal.Reactivating p53 and inducing tumor apoptosis(RITA) enhances the response of RITA-sensitive colorectal cancer cells to chemotherapeutic agents 5-fluorouracil and oxaliplatin〔J〕.Neoplasia，2017；19(4)：301-9.

2Sarveswaran S，Chakraborty D，Chitale D，etal.Inhibition of 5-lipoxygenase selectively triggers disruption of c-Myc signaling in prostate cancer cells〔J〕.J Biol Chem，2015；290(8)：4994-5006.

3Poczobutt JM，Nguyen TT，Hanson D，etal.Deletion of 5-lipoxygenase in the tumor microenvironment promotes lung cancer progression and metastasis through regulating T cell recruitment〔J〕.J Immunol，2016；196(2)：891-901.

4Zhou GX，Ding XL，Wu SB，etal.Inhibition of 5-lipoxygenase triggers apoptosis in pancreatic cancer cells〔J〕.Oncol Rep，2015；33(2)：661-8.

5Che XH，Chen CL，Ye XL，etal.Dual inhibition of COX-2/5-LOX blocks colon cancer proliferation，migration and invasion in vitro〔J〕.Oncol Rep，2016；35(3)：1680-8.

6李天客，陳 中，包 陽，等.RNA 干擾 SBF2 對人口腔癌細胞株 SCC15 增殖，凋亡及侵襲的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(21)：5260-2.

7Kumar R，Singh AK，Kumar M，etal.Serum 5-LOX：a progressive protein marker for breast cancer and new approach for therapeutic target〔J〕.Carcinogenesis，2016；37(9)：912-7.

8Wen Z，Liu H，Li M，etal.Increased metabolites of 5-lipoxygenase from hypoxic ovarian cancer cells promote tumor-associated macrophage infiltration〔J〕.Oncogene，2015；34(10)：1241-52.

9張海峰，周國雄，丁曉凌，等.靶向 5-LOX的siRNA誘導(dǎo)胰腺癌細胞的凋亡〔J〕.世界華人消化雜志，2008；16(19)：2107-11.

10武云峰，俞廣進，夏 俊，等.5-LOX siRNA 抑制人肝癌 HepG-2 細胞裸鼠移植瘤的生長并誘導(dǎo)細胞凋亡〔J〕.肝膽外科雜志，2016；24(1)：59-63.

11Wang X，Chen Y，Zhang S，etal.Co-expression of COX-2 and 5-LO in primary glioblastoma is associated with poor prognosis〔J〕.J Neurooncol，2015；125(2)：277-85.

12Li X，Wu G，Shang P，etal.Anti-nephrolithic potential of catechin in melamine-related urolithiasis via the inhibition of ROS，apoptosis，phospho-p38，and osteopontin in male Sprague-Dawley rats〔J〕.Free Rad Res，2015；49(10)：1249-58.

13Palit S，Kar S，Sharma G，etal.Hesperetin induces apoptosis in breast carcinoma by triggering accumulation of ROS and activation of ASK1/JNK pathway〔J〕.J Cell Physiol，2015；230(8)：1729-39.

14Chattopadhyay R，Tinnikov A，Dyukova E，etal.12/15-Lipoxygenase-dependent ROS production is required for diet-induced endothelial barrier dysfunction〔J〕.J Lipid Res，2015；56(3)：562-77.

15Ibrahim AS，Elshafey S，Sellak H，etal.A lipidomic screen of hyperglycemia-treated HRECs links 12/15-Lipoxygenase to microvascular dysfunction during diabetic retinopathy via NADPH oxidase〔J〕.J Lipid Res，2015；56(3)：599-611.

16Ruan J，Qi Z，Shen L，etal.Crosstalk between JNK and NF-κB signaling pathways via HSP27 phosphorylation in HepG2 cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2015；456(1)：122-8.

17Zhang J，Pan C，Xu T，etal.Interleukin 18 augments growth ability via NF-κB and p38/ATF2 pathways by targeting cyclin B1，cyclin B2，cyclin A2，and Bcl-2 in BRL-3A rat liver cells〔J〕.Gene，2015；563(1)：45-51.

18Claudius AK，Kankipati CS，Kilari RS，etal.Identification of aspirin analogues that repress NF-κB signalling and demonstrate anti-proliferative activity towards colorectal cancer in vitro and in vivo〔J〕.Oncol Rep，2014；32(4)：1670-80.

19Ratheesh M，Svenia JP，Asha S，etal.Anti-inflammatory effect of a novel formulation of coconut inflorescence sap against ox-LDL induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells by modulating TLR-NF-κB signaling pathway〔J〕.Toxicol Mechanisms Methods，2017；27(8)：615-21.

20Li B，Yang Y，Chen L，etal.18ɑ-Glycyrrhetinic acid monoglucuronide as an anti-inflammatory agent through suppression of the NF-κB and MAPK signaling pathway〔J〕.Med Chem Comm，2017；8(7)：1498-504.