周 亮 陳其玖 張建勇 劉 波 馬 龍

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸科，貴州 遵義 563000)

肺癌病變常由肺泡上皮的不典型增生及原位腺癌轉(zhuǎn)變而來，形成浸潤性腺癌后病變進(jìn)展迅速〔1〕?？缒さ鞍?PD)-1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，PD-L1是其配體，有共刺激性和共抑制性，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，與PD-1結(jié)合后，激活PD-1/PD-L1 信號系統(tǒng)，抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活性，使T淋巴細(xì)胞阻滯在G0/G1期，阻礙其分化為漿細(xì)胞，從而引起T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡，激活腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔2〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9不僅是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白，還對腫瘤的血管生成、腫瘤的間質(zhì)侵犯起明顯促進(jìn)作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)檢測浸潤性肺腺癌術(shù)后組織中PD-1、PD-L1和MMP-9的半定量表達(dá)，探討其臨床價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2014年1月至2016年12月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理醫(yī)師確診為浸潤性肺腺癌的患者75例為觀察組，均行根治手術(shù)，術(shù)后留取新鮮的腫瘤標(biāo)本，置于70%的酒精中保存。年齡50～87歲，平均66.8歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①多原發(fā)癌；②有肺部手術(shù)史；③伴有其他嚴(yán)重內(nèi)臟器官疾病。其中有轉(zhuǎn)移19例，無轉(zhuǎn)移56例。選擇上述患者中距腫物邊緣>3 cm的36例正常肺組織為對照組，年齡52～83歲，平均64.3歲，其中男20例，女16例。標(biāo)本留取方法同上。兩組在一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2PD-1、PD-L1和MMP-9蛋白的檢測 將術(shù)后應(yīng)用酒精固定的組織取出，用眼科剪子剪成粉末狀，置于銅網(wǎng)上輕搓，用0.9%的鹽水沖洗后，再次過濾。離心，將組織制備成單細(xì)胞懸液。每次檢測均取1 ml單細(xì)胞懸液后加入一抗、磷酸鹽緩沖液(PBS)及異硫氰酸熒光素(FITC)-IgG二抗，均嚴(yán)格操作方法，應(yīng)用美國BC公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀，應(yīng)用系統(tǒng)自帶的軟件(Expo 32 ADC)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3結(jié)果判定 應(yīng)用熒光指數(shù)(FI)為結(jié)果表達(dá)值。FI=(腫瘤中蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度-對照樣品平均熒光強(qiáng)度)/正常對照樣品平均熒光強(qiáng)度。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析，線性相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1PD-1、PD-L1和MMP-9在兩組中的表達(dá) PD-1、PD-L1和MMP-9在觀察組中表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 PD-1、PD-L1和MMP-9在兩組中表達(dá)

2.2PD-1、PD-L1和MMP-9的表達(dá)在觀察組不同臨床病理特征中的比較 PD-1、PD-L1和MMP-9的表達(dá)量均與腫瘤最大徑和增殖指數(shù)有關(guān)，MMP-9的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，三者均與腫瘤的性別、年齡無關(guān)。見表2。

2.3觀察組PD-1、PD-L1和MMP-9的相關(guān)性 PD-1和MMP-9、PD-L1和MMP-9的表達(dá)均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表2 PD-1、PD-L1和MMP-9的表達(dá)在觀察組不同臨床病理特征中的比較

3 討 論

浸潤性肺腺癌常見類型有腺泡型、乳頭型、黏液型、非黏液型、胎兒型、透明細(xì)胞型等〔4〕。腫瘤細(xì)胞間質(zhì)中可見到以淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤。淋巴細(xì)胞作為腫瘤間質(zhì)微環(huán)境中的重要成分，參與腫瘤的進(jìn)展及免疫性微環(huán)境的形成過程。機(jī)體對抗腫瘤細(xì)胞重要的是細(xì)胞免疫，T淋巴細(xì)胞是重要角色，T淋巴細(xì)胞能抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞〔5〕。T淋巴細(xì)胞激活需要兩個信號的協(xié)同作用：T淋巴細(xì)胞激發(fā)的第一信號是T淋巴細(xì)胞受體識別主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-抗原復(fù)合物，即T淋巴細(xì)胞對抗原的特異性識別；第二信號是抗原遞呈細(xì)胞(APC)所表達(dá)的共刺激分子與T細(xì)胞所表達(dá)的共刺激分子受體結(jié)合，傳遞的共刺激信號〔6〕。PD-1是一種50～55 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是B7-CD28家族成員，主要以細(xì)胞表面受體形式表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞，目前其有PD-L1和PD-L2兩個配體，主要表達(dá)于APC上，其作用主要是抑制信號傳遞到T細(xì)胞受體。也有研究認(rèn)為其可以增加P15的表達(dá)同時抑制細(xì)胞周期調(diào)控因子細(xì)胞S期激酶相關(guān)蛋白(SKP)2轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞停滯于G1期〔7〕。研究顯示PD-1通路參與慢性感染的免疫性調(diào)節(jié)，高表達(dá)時可以耗盡持續(xù)活化的T細(xì)胞，使T細(xì)胞喪失增殖和消滅侵入機(jī)體的微生物的功能，使感染持續(xù)存在。喪失活性的T細(xì)胞可以減少機(jī)體免疫性的損傷〔8〕。在腫瘤細(xì)胞中，PD-L1可以作為抗凋亡因子起作用，表達(dá)到APC上的PD-L1可與T細(xì)胞的相關(guān)蛋白結(jié)合，降低T細(xì)胞活性和細(xì)胞因子的生成，同時可以上調(diào)PD-L1的表達(dá)，使T細(xì)胞釋放干擾素，引起失活的T細(xì)胞表達(dá)PD-1，進(jìn)一步引起腫瘤細(xì)胞獲得逃避免疫清除的能力。MMP-9正常情況表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，尤其是高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞，其可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周圍基質(zhì)和基底膜發(fā)生降解，引起腫瘤細(xì)胞離開原灶并形成遷移，同質(zhì)性黏附和異質(zhì)性黏附共同起作用，使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移〔9〕。

本文結(jié)果顯示PD-1、PD-L1和MMP-9三者高表達(dá)是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生成的重要因素。由于PD-1表達(dá)于間質(zhì)，是細(xì)胞微環(huán)境的一部分，其在流式細(xì)胞半定量時表達(dá)較好。本文結(jié)果顯示PD-1、PD-L1和MMP-9三者高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的生長及細(xì)胞增殖。PD-L1可以在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而正常機(jī)體的細(xì)胞中常不表達(dá)。PD-1通路能降低腫瘤局部微環(huán)境T細(xì)胞免疫效應(yīng)，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，引起腫瘤的生長〔10〕。其機(jī)制有：①誘導(dǎo)并增加T細(xì)胞數(shù)量；②增強(qiáng)腫瘤特異性的殺傷活性；③使促炎相關(guān)因子高表達(dá)；④引起T細(xì)胞聚集現(xiàn)象；⑤下調(diào)潛在的抑制性細(xì)胞因子。有研究認(rèn)為PD-1和PD-L1是負(fù)性共刺激分子，腫瘤細(xì)胞高表達(dá) PD-L1，其與PD-1結(jié)合后，傳導(dǎo)抑制性信號，減少 CD8+T淋巴細(xì)胞增殖，甚至誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)下降，腫瘤細(xì)胞得以發(fā)生、發(fā)展〔11〕。而且PD-1/PD-L1信號通路可以抑制干擾素的產(chǎn)生，刺激T淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素10，抑制T細(xì)胞的活性〔12〕。本文結(jié)果提示MMP-9高表達(dá)時可以促進(jìn)腫瘤淋巴道播散。MMP-9是轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，其具有多向調(diào)節(jié)作用，如對血管生成的調(diào)節(jié)作用、促進(jìn)細(xì)胞增殖等〔13，14〕，本實(shí)驗(yàn)提示PD-1、PD-L1和MMP-9三者間無協(xié)同作用，因此PD-1/PD-L1和MMP-9的調(diào)節(jié)可能是通過各自的通路完成的。

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