劉建新，歐曉彬，王金成，劉秀麗，李博萍

(甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅慶陽(yáng) 745000)

中國(guó)是稀土儲(chǔ)量最豐富的國(guó)家，稀土開(kāi)發(fā)利用造成的生態(tài)破壞與環(huán)境污染備受關(guān)注[1]。鑭(La)是稀土元素中性質(zhì)最活潑的一種，其在地殼中的豐度也最大，占稀土總豐度的14.1%。稀土在冶金、石油、紡織和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用使儲(chǔ)量豐富和性質(zhì)活潑的La元素大量進(jìn)入環(huán)境并產(chǎn)生積累，造成農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境污染和作物生長(zhǎng)發(fā)育受阻[2]。有研究報(bào)道，La脅迫下，黑麥草(Loliumperenne)[3-4]和燕麥(Avenanuda)[5]幼苗活性氧過(guò)量積累，導(dǎo)致細(xì)胞膜氧化損傷，碳、氮代謝紊亂，礦質(zhì)元素吸收受阻，光合作用下降，生長(zhǎng)發(fā)育受抑；高濃度La抑制煙草(Nicotianatabacum)葉綠體的光化學(xué)反應(yīng)[6]和光合碳同化酶活性[7]，使煙草光合速率和干物質(zhì)積累量下降[8]，黃瓜(Cucumissativus)細(xì)胞膜脂酸比發(fā)生改變[9]、類囊體結(jié)構(gòu)遭受破壞和光合活性降低[10]，水稻(Oryzasativa)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收分配變化[11]和抗氧化防御系統(tǒng)活性下降[12]。因此，探索提高農(nóng)作物對(duì)La脅迫的抗性途徑具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

一氧化氮(nitric oxide,NO)是生物體內(nèi)的一種氣體信號(hào)分子，在增強(qiáng)植物對(duì)重金屬脅迫抗性方面具有重要作用[13]。研究表明，外源NO可明顯緩解Cu、Cd脅迫對(duì)番茄(Lycopersiconesculentum)生長(zhǎng)發(fā)育的抑制作用[14]，并通過(guò)提高活性氧清除能力和維持礦質(zhì)元素平衡，緩解Cd脅迫對(duì)番茄幼苗葉片光合機(jī)構(gòu)的破壞[15]。錳脅迫下，NO通過(guò)調(diào)控抗氧化系統(tǒng)減輕了水稻(Oryzasativa)的膜脂過(guò)氧化程度[16]。La脅迫下，外施NO可增強(qiáng)黑麥草幼苗超氧化物歧化酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性，提高葉片光化學(xué)效率，促進(jìn)碳、氮代謝正常運(yùn)轉(zhuǎn)和礦質(zhì)元素吸收[3-4]；外施NO還可維持La脅迫下燕麥幼苗活性氧代謝的平衡，緩解La脅迫對(duì)K、Ca、Mg、Fe吸收及植株生長(zhǎng)的抑制[5]?？箟难?谷胱甘肽循環(huán)(ascorbate-glutathione cycle,AsA-GSH)是植物清除活性氧的酶促催化系統(tǒng)，在植物抵抗逆境脅迫傷害方面發(fā)揮著重要作用[17]。肖 強(qiáng)等[18]研究發(fā)現(xiàn)，NO可阻斷高濃度La處理下水稻超氧化物歧化酶活性和還原型谷胱甘肽含量的下降及H2O2含量的上升，從而緩解La引起的氧化脅迫。李曉云等[19]報(bào)道，外源NO 參與了Cu脅迫下番茄幼苗根系的AsA-GSH循環(huán)調(diào)節(jié)，減緩了Cu脅迫對(duì)根系的毒害。燕麥(Avenanuda)是禾本科燕麥屬一年生小雜糧作物，具有喜陰涼、耐貧瘠、抗鹽、耐旱等生態(tài)學(xué)特性，是生態(tài)脆弱地區(qū)不可替代的特色糧飼兼用型作物[20]。外源NO能否調(diào)控La脅迫下燕麥AsA-GSH循環(huán)代謝，從而緩解La誘導(dǎo)的氧化傷害，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)擬研究外源NO供體硝普鈉(Sodium nitroprusside， SNP)對(duì)La脅迫下燕麥幼苗葉片過(guò)氧化氫(H2O2)產(chǎn)生及AsA-GSH循環(huán)中抗氧化物質(zhì)和相關(guān)代謝酶活性的影響，探討La脅迫下NO調(diào)控AsA-GSH循環(huán)代謝的機(jī)理，旨在為減輕稀土重金屬對(duì)植物的傷害提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年4-7月在甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室日光溫室進(jìn)行。供試燕麥品種為定莜6號(hào)，由甘肅省定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心提供。氯化鑭(LaCl3·2.5H2O)提供La3+，NO供體為SNP{[Na2Fe(CN)5]NO}，均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 鑭脅迫濃度和SNP處理濃度的篩選

選飽滿一致的健康燕麥種子，用0.5% NaClO表面消毒后播種在21個(gè)培養(yǎng)皿(直徑12 cm)中，基質(zhì)為珍珠巖，澆水后在25 ℃、150 μmol·m-2·s-1和14 h/10 h(光照/黑暗)條件下培養(yǎng)；待幼苗2葉1心時(shí)將21個(gè)培養(yǎng)皿分為7組，每組3皿，分別用濃度為0、25、50、100、200、400、800 μmol·L-1氯化鑭(LaCl3·2.5H2O)溶液沖洗幼苗根部3次，每皿澆灌相應(yīng)濃度的氯化鑭溶液15 mL；在上述條件下培養(yǎng)12 d，取幼苗倒數(shù)第2～3片展開(kāi)葉，測(cè)定丙二醛(MDA)含量，以MDA含量顯著高于對(duì)照(0 μmol·L-1LaCl3·2.5H2O)的最低濃度作為氯化鑭處理濃度。在選出的氯化鑭溶液中分別添加0、10、25、50、100、150、200、250、300 μmol·L-1SNP溶液，用上述方法在同樣條件下培養(yǎng)12 d后，測(cè)定幼苗倒數(shù)第2～3片葉的MDA含量，以MDA含量最低的SNP濃度作為進(jìn)一步進(jìn)行氯化鑭和SNP交叉處理的濃度。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

精選的燕麥種子播種在裝滿珍珠巖的塑料盆(口徑20 cm，高14 cm)中，每盆播約300粒，澆水后置溫室培養(yǎng)，溫度18～35 ℃，濕度65%～87%，光照度480～730 μmol·m-2·s-1，幼苗1葉1心時(shí)選150株健壯植株轉(zhuǎn)移至4 L水培箱中，用1/2 Hoagland溶液培養(yǎng)，培養(yǎng)一周后換成Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液，此后每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液；當(dāng)幼苗2葉1心時(shí)進(jìn)行LaCl3·2.5H2O和SNP交叉處理：(1)對(duì)照(CK)，Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；(2)La處理，含1.2中篩選出的La濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；(3)La + SNP，含1.2中篩選出的 La和SNP的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；(4)SNP，含1.2中篩選出的 SNP的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。為防止PO43-與La3+形成沉淀，配制Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液時(shí)省略了磷酸二氫鹽，以每日向幼苗葉面噴施等量0.5 mmol·L-1KH2PO4溶液替代。每個(gè)處理重復(fù)3次，隨機(jī)排列。處理期間每天更換處理液，電動(dòng)氣泵連續(xù)通氣，pH調(diào)節(jié)至6.0±0.32。處理12 d后，分別取幼苗倒數(shù)第2～3片葉，液氮速凍后-80 ℃下保存，用于相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 H2O2和MDA含量的測(cè)定

稱取0.50 g樣品，用5 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液(PBS，pH 7.0)冰浴研磨，12 000 r·min-1、4 ℃離心30 min，上清液為待測(cè)提取液。H2O2含量測(cè)定參照Sergiev等[21]的方法，MDA含量測(cè)定按Predieri等[22]的方法。

1.4.2 AsA、DHA、GSH、GSSG含量的測(cè)定

稱取1.00 g樣品，用4 mL 6%三氯乙酸冰浴研磨，13 000 r·min-1冷凍離心10 min，取上清液按Kampfenkel等[23]的方法測(cè)定還原型抗壞血酸(AsA)和脫氫抗壞血酸(DHA)含量。稱取1.00 g 樣品用3.75 mL、0.1 mol·L-1PBS(pH 8.0，含5 mmol·L-1EDTA)和1 mL 25%磷酸冰浴研磨，15 000 r·min-1冷凍離心30 min后取上清液，按Hissin等[24]的方法測(cè)定還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量。

1.4.3 MDHAR、DHAR、APX、GR活性的測(cè)定

稱取1.00 g 樣品，用6 mL 50 mmol·L-1pH 7.0 PBS(含2 mmol·L-1EDTA、2 mmol·L-1DTT、20%甘油、2% PVP)冰浴研磨，10 000 r·min-1冷凍離心30 min，取上清液測(cè)定單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性。MDHAR和DHAR活性按Ma等[25]的方法測(cè)定波長(zhǎng)在340 nm和265 nm吸光值OD的變化，以1 min內(nèi)OD340值變化0.01為一個(gè)MDHAR活性單位(U)，以1 min內(nèi)OD265值變化0.01為一個(gè)DHAR活性單位(U)。APX活性按陳建勛等[26]的方法測(cè)定，以1 min內(nèi)OD290變化0.01為1個(gè)酶活單位(U)。GR活性按Foyer等[27]的方法測(cè)定OD340值，以1 min內(nèi)OD340變化0.01為一個(gè)酶活單位(U)。

1.4.4 La含量的測(cè)定

取氯化鑭和SNP交叉處理12 d的幼苗50株，用5 mol·L-1EDTA溶液浸泡15 min后用蒸餾水淋洗干凈，直尺測(cè)量自根結(jié)至主根尖長(zhǎng)度和最高葉尖高度，分別作為根長(zhǎng)和株高。將幼苗從根結(jié)處分成根系和地上部，于105±1 ℃殺青20 min，70 ℃烘干至恒重。將烘干根系和地上部磨細(xì)過(guò)0.18 mm尼龍篩，分別稱取0.250 g在微波消化系統(tǒng)中用10 mL HNO3-HClO4(v∶v=8∶1)消化并定容至50 mL，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(DRE型，美國(guó)Lee man公司)測(cè)定La含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析、Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化鑭和硝普鈉處理濃度的篩選

從圖1可見(jiàn)，氯化鑭(LaCl3·2.5H2O)處理濃度為25～100 μmol·L-1時(shí)，燕麥幼苗葉片MDA含量與CK(0 μmol·L-1)無(wú)顯著差異，200～800 μmol·L-1氯化鑭處理顯著提高了燕麥葉片的 MDA含量。因此，氯化鑭脅迫濃度選擇200 μmol·L-1。在200 μmol·L-1氯化鑭脅迫下，10～300 μmol·L-1SNP處理燕麥葉片的MDA含量呈先降后升趨勢(shì)，以100 μmol·L-1SNP處理的MDA含量下降幅度最大，且顯著低于未添加SNP處理，所以進(jìn)一步的試驗(yàn)中SNP濃度選用100 μmol·L-1。

圖柱上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Different letters above columns represent significant difference at 0.05 level among treatments.The same in other figures.

圖1不同濃度氯化鑭脅迫及硝普鈉處理下燕麥幼苗葉片的丙二醛含量

Fig.1MDAcontentofoatleavesunderdifferentLaCl3·2.5H2OandSNPtreatments

2.2 不同處理對(duì)燕麥幼苗葉片H2O2和MDA含量的影響

由圖2可知， La脅迫較CK顯著提高了燕麥幼苗葉片的H2O2和MDA含量，增幅分別為88.8%和64.7%；La + SNP處理與單獨(dú)La處理相比，H2O2和MDA含量分別下降了25.3%和31.0%，差異顯著；SNP單獨(dú)處理的H2O2和MDA含量分別比CK降低了40.8%和38.9%，差異顯著。說(shuō)明外源NO能夠抑制燕麥幼苗葉片的H2O2積累對(duì)膜脂的過(guò)氧化傷害。

CK、La、La+SNP、SNP 分別表示0 μmol·L-1、200 μmol·L-1LaCl3·2.5H2O、200 μmol·L-1LaCl3·2.5H2O+100 μmol·L-1SNP、100 μmol·L-1SNP處理。下同。

CK,La,La+SNP and SNP represent the treatments of control,200 μmol·L-1LaCl3·2.5H2O,200 μmol·L-1LaCl3·2.5H2O + 100 μmol·L-1SNP and 100 μmol·L-1SNP,respectively. The same in other table and figures.

圖2不同處理對(duì)鑭脅迫下燕麥幼苗葉片H2O2和丙二醛含量的影響

Fig.2EffectofdifferenttreatmentonH2O2andMDAcontentinleavesofoatseedlings

2.3 不同處理對(duì)燕麥幼苗生長(zhǎng)和植株La含量的影響

從表1可見(jiàn)，與CK相比，La處理顯著降低了燕麥幼苗的根長(zhǎng)、株高、根系和地上部干重，分別下降35.5%、29.7%、35.1%和29.9%；顯著提高了根系和地上部La含量，分別提高12.7倍和20.1倍；與La處理相比，La+SNP處理顯著提高了燕麥幼苗根長(zhǎng)、株高及根系和地上部干重，分別提高35.2%、22.0%、22.0%和20.3%，根系La含量沒(méi)有顯著變化，地上部La含量顯著降低；單獨(dú)SNP處理除顯著提高了燕麥幼苗地上部干重外，其他被測(cè)指標(biāo)與CK均無(wú)顯著差異。

表1外源NO對(duì)La脅迫下燕麥幼苗生長(zhǎng)及植株La含量的影響

Table1EffectofexogenousNOongrowthandlanthanumcontentinoatseedlingsunderLastress

處理Treatment根長(zhǎng)Rootlength/cm株高Plantheight/cm每株干重Dryweightperplant/mg根系Root地上部Shoot根系La含量RootLacontent/(mg·g-1DW)地上部La含量ShootLacontent/(mg·g-1DW)CK13．15±0．59a17．25±0．39a11．22±0．30a20．24±0．97b7．72±0．16b3．65±0．06cLa8．48±0．63c12．13±0．47c7．28±0．46c14．19±1．11d105．56±2．26a76．84±1．71aLa+SNP11．46±0．26b14．80±0．26b8．88±0．26b17．07±0．29c107．08±4．14a63．05±3．07bSNP13．98±0．48a17．46±0．65a11．35±0．41a22．93±0．59a7．66±0．31b3．71±0．15c

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異在0.05水平顯著。

Values within same column followed by different small letters are significantly different at 0.05 level.

2.4 不同處理對(duì)燕麥幼苗葉片抗氧化物質(zhì)含量的影響

2.4.1 AsA、DHA、GSH和GSSG含量的變化

從圖3可見(jiàn)，La脅迫下燕麥幼苗葉片AsA、DHA、GSH、GSSG含量與CK相比顯著提高，分別提高51.4%、96.2%和2.75倍、5.43倍；La+SNP處理的AsA、DHA、GSH、GSSG含量與單獨(dú)La處理相比分別下降了26.7%、44.7%、42.7%、58.6%，差異達(dá)顯著水平；SNP單獨(dú)處理的AsA和DHA含量較CK分別提高了39.1%和40.2%，差異顯著；GSH和GSSG含量顯著下降，分別降低了22.2%和20.3%。

圖3 不同處理對(duì)燕麥幼苗葉片AsA、DHA、GSH和GSSG含量的影響

2.4.2 AsA/DHA和GSH/GSSG的變化

La脅迫下燕麥幼苗葉片AsA/DHA和GSH/GSSG顯著下降，分別比CK下降了22.8%和41.7%(圖4)；La + SNP處理的AsA/DHA和GSH/GSSG較單獨(dú)La處理顯著提高，分別提高了32.5%和38.4%；SNP單獨(dú)處理的AsA/DHA和GSH/GSSG與CK相比無(wú)顯著差異。

2.5 不同處理對(duì)燕麥幼苗葉片AsA-GSH循環(huán)相關(guān)代謝酶活性的影響

由圖5可知， La脅迫顯著提高了燕麥幼苗葉片的MDHAR、DHAR、APX和GR活性，分別比CK提高了84.6%、49.9%、60.1%和115.1%；La + SNP處理的MDHAR、DHAR、APX和GR活性分別比La單獨(dú)處理提高了49.6%、28.5%、21.3%和54.1%，差異顯著；SNP單獨(dú)處理的MDHAR、DHAR和GR活性與CK相比顯著提高，增幅分別為81.4%、32.8%和174.2%，而APX活性與CK無(wú)顯著差異。

圖4 不同處理對(duì)燕麥幼苗葉片AsA/DHA和GSH/GSSG的影響

圖5 不同處理對(duì)燕麥幼苗葉片MDHAR、DHAR、APX和GR活性的影響

3 討 論

抗壞血酸和谷胱甘肽是AsA-GSH循環(huán)中兩種主要的抗氧化物質(zhì)，AsA在APX催化下清除H2O2的同時(shí)自身被氧化成單脫氫抗壞血酸(MDHA)，MDHA可被MDHAR重新還原成AsA，MDHA也可通過(guò)非酶促歧化生成DHA，DHA由GSH提供電子在DHAR催化下還原為AsA，而GSH則被氧化成GSSG[17]，GSSG可由GR催化NADPH提供電子還原重新形成GSH[19]。因此，AsA、DHA、GSH、GSSG含量及AsA/DHA、GSH/GSSG比值的變化與植物重金屬脅迫耐性密切相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，La脅迫在誘導(dǎo)燕麥葉片AsA、DHA和GSH、GSSG含量提高的同時(shí)，卻導(dǎo)致AsA/DHA和GSH/GSSG降低；外施SNP能夠有效減緩La脅迫燕麥葉片AsA、DHA和GSH、GSSG含量增幅，并提高AsA/DHA和GSH/GSSG，卻使正常生長(zhǎng)條件下的燕麥葉片AsA、DHA含量提升，GSH、GSSG含量下降，而AsA/DHA和GSH/GSSG保持不變。另外，AsA和DHA含量以單一La與單一SNP處理高于La + SNP處理，其原因可能與相關(guān)代謝酶活性有關(guān)，在La + SNP處理下顯著高于單一La與單一SNP處理的DHAR活性催化DHA還原生成更多AsA，從而可能使La + SNP處理的DHA含量低于單一La與單一SNP處理，而La + SNP處理下顯著高于單一La與單一SNP處理的APX活性催化AsA更多生成MDHA，而使AsA含量低于單一La與單一SNP處理。而GSH和GSSG含量表現(xiàn)為單一La處理>La+SNP處理>CK>單一SNP處理，推測(cè)可能是燕麥在遭受La脅迫后為了加強(qiáng)抗氧化防御合成了更多的GSH[30]，而添加SNP后因NO本身可作為抗氧化物質(zhì)直接與活性氧作用[28]或激活抗氧化防御能力[4,15]，從而降低氧化傷害后減少了GSH的合成，即使在細(xì)胞正常代謝條件下產(chǎn)生的活性氧清除也可能如此；另一方面，SNP處理提高正常和La脅迫下燕麥的DHAR活性還會(huì)加速GSH向GSSG轉(zhuǎn)化，使GSH含量下降，結(jié)果使GSH含量為單一La處理>La+SNP處理>CK>單一SNP處理。而SNP處理提高了正常和La脅迫下燕麥的GR活性，促進(jìn)GSSG向GSH轉(zhuǎn)化，使GSSG含量也表現(xiàn)為單一La處理>La+SNP處理>CK>單一SNP處理。由此表明，NO參與La脅迫下燕麥幼苗AsA-GSH循環(huán)中AsA和GSH氧化還原平衡的調(diào)節(jié)，這與Panda等[31]的外源NO能夠抑制鎘誘導(dǎo)的水稻AsA和GSH含量升高的結(jié)果一致，但與李曉云等[19]的外源NO降低銅脅迫下番茄根系A(chǔ)sA和GSH含量而提高DHA和GSSG含量的結(jié)果有所不同，這可能與脅迫類型、脅迫強(qiáng)度或植物種類、組織器官有關(guān)。

MDAR、DHAR、APX和GR是AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，對(duì)AsA和GSH的再生及AsA-GSH循環(huán)有效運(yùn)轉(zhuǎn)具有重要作用。有研究表明，外源NO能夠提高銅脅迫下番茄幼苗根系的MDHAR和DHAR活性，降低APX和GR活性[19]。NaCl脅迫下NO顯著提高了黑麥草幼苗葉片的APX、GR和DHAR活性，卻對(duì)MDAR活性無(wú)顯著影響[32]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，La脅迫下燕麥葉片MDHAR、DHAR、APX和GR活性顯著提高，外施SNP能提高正常生長(zhǎng)和La脅迫下燕麥葉片的MDHAR、DHAR和GR活性及La脅迫下的APX活性，卻對(duì)正常生長(zhǎng)條件下的APX活性影響不大。說(shuō)明外源NO能夠通過(guò)提高M(jìn)DHAR、DHAR、APX和GR活性促進(jìn)La脅迫燕麥幼苗AsA-GSH循環(huán)的有效運(yùn)轉(zhuǎn)，這與NO處理能夠提高低溫脅迫下枇杷(Eriobotryajaponica)葉片APX、GR、DHAR和MDAR活性的結(jié)果一致[33]。NO對(duì)MDHAR和DHAR活性的提高，有效抑制MDHA的歧化并促進(jìn)MDHA與DHA向AsA的轉(zhuǎn)化，維持細(xì)胞充足的AsA庫(kù)源，使AsA/DHA提高，從而增強(qiáng)活性提高的APX對(duì)H2O2的清除能力；NO對(duì)GR活性的提高促進(jìn)GSSG的還原，提高GSH/GSSG，從而保證AsA-GSH循環(huán)的有效運(yùn)轉(zhuǎn)。

綜上所述，外源NO可抑制La脅迫下La從根系向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，并通過(guò)激活MDHAR、DHAR、APX和GR活性，促進(jìn)AsA和GSH再生，提高AsA/DHA和GSH/GSSG比值，從而減輕La脅迫誘導(dǎo)的H2O2等活性氧積累對(duì)燕麥幼苗的傷害，降低La脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制程度。

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