施 璇，李 磊，鄭 彤，駱 孟，李 韜

(揚州大學江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學重點實驗室/小麥研究中心，江蘇揚州 225009)

植物過敏反應(hypersensitive reaction,HR)指植物和病原菌不親和互作后，細胞快速壞死的抗病反應，而小麥類過敏反應(hypersensitive reaction-like,HRL)是指植株在無病害侵染也未受逆境或損傷的條件下，葉片上自發(fā)形成與病原物侵染后過敏反應類似的性狀，也稱為擬壞死(lesion mimic,LM)，它們與植物抗病及細胞程序化死亡相關(guān)[1]。HRL性狀對維持植物的廣譜抗性至關(guān)重要(廣譜抗性是指對同一病原菌的不同生理小種或不同病原菌都具有抗性)。HRL現(xiàn)象最早在玉米中被發(fā)現(xiàn)，隨后在大麥、擬南芥、水稻等植物上也相繼報道了該表型的突變體[2]。

很多證據(jù)表明，大部分控制HRL性狀的基因參與了過敏性反應以及植物抗病信號轉(zhuǎn)導途徑，該類基因表達往往與植物廣譜抗性直接關(guān)聯(lián)，絕大部分表現(xiàn)為對某一病原菌的所有已知生理小種都有抗性。例如，擬南芥的HRL突變體lsd1和acd與野生型相比較，能夠顯著提高對細菌和霜霉病菌的抗性[3-5]。大麥HRL突變體mlo對所有已知的大麥白粉菌均表現(xiàn)優(yōu)異的抗性[6]。水稻HRL突變體cdr1、cdr2、cdr3和ebr3對稻瘟病菌表現(xiàn)高抗，而另一個單基因細胞核隱性水稻類病變壞死突變體lmm1對紋枯病真菌具有較野生型更強的廣譜抗性[7]。

小麥HRL突變體的研究水平遠遠落后于其它作物。Kamlofski等[8]用EMS法處理阿根廷小麥品種獲得HRL突變體，該突變體高抗小麥葉銹病，而且不影響產(chǎn)量；Anand等在小麥中轉(zhuǎn)入幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶基因，轉(zhuǎn)基因小麥在葉片上出現(xiàn)類似過敏性反應的壞死斑，有HRL表型的轉(zhuǎn)基因植物提高了對銹病和赤霉病的抗性[9]。Li等[10]通過混池轉(zhuǎn)錄組測序的方法發(fā)現(xiàn)，二萜化合物相關(guān)的壓力應激反應介導了類過敏反應性狀和廣譜抗性的產(chǎn)生，而氧化磷酸化、蛋白酶解體和光合途徑與小麥類過敏反應表型相關(guān)。

氮肥是影響小麥產(chǎn)量和籽粒品質(zhì)的重要物質(zhì)，由于其顯著的增產(chǎn)作用，在過去的幾十年中，氮肥消耗量在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料投入中保持著持續(xù)增長的趨勢[11]。然而，早在上個世紀的研究即表明，過多的施用氮肥不僅造成作物品質(zhì)下降和污染環(huán)境，還可能加重作物的病害。杜 娟等[12]研究表明，高氮肥使大麥白粉病嚴重度和病情指數(shù)極顯著升高。水稻白葉枯病屬于典型高氮病害，過量施用氮肥能加重該病的發(fā)生，低氮脅迫則提高感病品種對白葉枯病的抗性[13]。隨著施氮水平的提高，抗白粉病和霜霉病的植保素的合成量減少，從而增加了小麥白粉病和霜霉病的嚴重度[14]。過多的氮素供應降低了作物的抗病性已成為一個共識，研究者多從作物群體結(jié)構(gòu)和生理指標兩個方面來解釋氮素通過何種途徑降低作物的抗病性。在作物群體結(jié)構(gòu)方面，過多的氮素供應導致群體密度過大，通風透光差，增加了田間濕度，有利于病原菌的侵染和繁衍。從生理指標看，過多的氮素供應可能提高了植株外質(zhì)體中氨基酸和酰胺的濃度，降低了木質(zhì)素含量以及硅的積累，從而導致植物抗病性的降低[15]。但迄今為止，氮素影響植物抗病性的分子機制的研究鮮有報道。

由專性寄生真菌小麥白粉病菌(BlumeriagraminisDC f. sp.tritici)引起的小麥白粉病是中國和世界上許多國家小麥生產(chǎn)中危害日趨嚴重的病害之一[16]。培育抗性品種是防治白粉病的最為有效的方法。小麥對白粉病的抗性包括水平抗性和垂直抗性，遺傳基礎(chǔ)復雜，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了58個抗性位點、78個抗性等位基因[17]和100多個數(shù)量性狀位點(QTLs)。小麥白粉病菌復雜多變的特性，易導致小麥單個抗病基因抗性的喪失。所以，培育廣譜抗性品種對防控小麥白粉病流行至關(guān)重要。

寧7840是由江蘇省農(nóng)科院選育的一個多抗高代品系，對赤霉病、銹病和白粉病都具有良好的抗性。該品種攜帶HRL性狀，之前將寧7840作為赤霉病和銹病的研究材料的報道較多，小黑麥中1RS染色體上存在條銹病、葉銹病、稈銹病和白粉病等抗性基因，李 韜等[18]發(fā)現(xiàn)寧7840的染色體中可能存在1BL/1RS易位，提高了對赤霉病的抗性。Li等[19]利用寧7840和Clark雜交得到的RIL群體在小麥的1BS上定位到一個抗葉銹病基因，但未見將寧7840作為研究白粉病材料的報道。 本研究通過對寧7840進行EMS誘變和連續(xù)選擇，共篩選得到14個比野生型目標性狀更為明顯的突變體，對這14個突變體進行不同氮素水平的處理，調(diào)查氮素豐、缺條件下不同突變體的HRL表型、白粉病抗性、葉綠素含量以及氮肥吸收利用效率，旨在篩選高抗白粉病且氮肥吸收利用效率高的小麥突變體，從而減少化肥和農(nóng)藥投入，有利于糧食安全、環(huán)境安全和食品安全。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為多抗高代小麥品系寧7840(阿芙樂爾/安徽11號//蘇麥3號)及其14個Mu4代HRL加強型純合突變體。

1.2 試驗方法

試驗于2015-2016年在揚州大學溫室內(nèi)完成。盆栽種植寧7840和14個突變體，每盆定苗至6株。供試土壤取自稻茬田塊表土，土壤中速效氮42.6 mg·kg-1，速效磷42.81 mg·kg-1，速效鉀92.93 mg·kg-1，有機質(zhì)10.05 g·kg-1。每個材料設(shè)4個氮肥(尿素,氮素含量≥46.0%)水平，分別為0 g、3 g、6 g和9 g(約相當于每公頃施純氮0 kg、63 kg、126 kg和189 kg)，每個水平設(shè)置兩個重復，每個重復兩盆，氮肥(尿素，含氮量≥46.0%)在小麥苗期以基施的方式一次性施入。

1.2.1 植株全氮含量的測定和氮肥吸收利用效率的計算

在小麥拔節(jié)期和成熟后分別取樣，成熟期的秸稈和麥穗分別收獲，拔節(jié)期樣本先在105 ℃烘箱中殺青1 h，然后75 ℃烘干；成熟期樣本直接在75 ℃烘箱中烘干，然后粉碎。每個材料設(shè)置兩個重復，每個重復稱量1 g，采用KDY-9830全自動凱氏定氮儀自動定氮法測定硫酸-混合加速劑消煮后的樣本全氮含量(mg·g-1)。

氮肥吸收利用率=(氮處理植株吸氮量-缺氮處理植株吸氮量)/施氮量[20]。

1.2.2 葉綠素含量的測定

在小麥孕穗期用SPAD儀(SPAD-502)測量每盆每株小麥旗葉的葉綠素含量，每張葉片測上、中、下三個部分，取其平均值。

1.2.3 白粉病嚴重度調(diào)查

白粉病接種是將另一隔離溫室中自發(fā)感染白粉病的拔節(jié)期小麥葉片剪下，直接將葉片上附著的白粉病病原菌抖落在盆栽中的小麥植株上，接種10～15 d后調(diào)查小麥植株的倒一(D1)、倒二(D2)和倒三葉(D3)的白粉病發(fā)病的嚴重程度(PIA)。白粉病嚴重程度根據(jù)孢子堆所占面積占D1、D2和D3葉面積的百分比進行估算，并對倒一葉、倒二葉和倒三葉的白粉病嚴重度分別賦值，評價值(PIA)=0.5*D1+0.3*D2+0.2*D3，PIA=0為免疫，0

1.3 數(shù)據(jù)計算及分析

氮含量、白粉病的嚴重度分布圖用Excel 2007制作，基本描述性統(tǒng)計、方差分析和多重比較用Matlab軟件(MathWorks Inc.,Natick,MA,USA)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型突變體與施氮量的關(guān)系

類過敏反應表型在拔節(jié)期開始表達，在抽穗期表型最明顯。在抽穗期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，野生型及其14個HRL突變體植株對氮肥響應不同，根據(jù)其對氮肥的敏感性分為氮依賴型和非氮依賴型兩種類型。野生型在低氮(0和3 g尿素·盆-1)條件下能夠誘導HRL性狀的提早表達，隨著施氮量的增加，HRL性狀會逐漸消失，因此屬于氮依賴型(圖1a)。在14個突變體中，有12個為氮依賴型，其中3個突變體(NMu-HRL-3、NMu-HRL-4和NMu-HRL-5)與野生型對氮肥的響應略有差異：野生型在3 g尿素·盆-1處理下，HRL性狀開始消失，而這3個突變體在6 g尿素·盆-1處理下HRL性狀才逐漸消失(表1)。另外，在高氮(6和9 g尿素·盆-1)條件下，有2個突變體(NMu-HRL-1和NMu-HRL-2)的HRL表型的葉面壞死病斑不會消失，為非氮依賴型(圖1b)。

a：氮依賴型突變體；b：非氮依賴型突變體。CK:0 g尿素·盆-1；Trt1:3 g尿素·盆-1；Trt2:6 g尿素·盆-1；Trt3:9 g尿素·盆-1。下同。

a:Nitrogen-dependent mutants; b:Nitrogen-independent mutants; CK:0 g urea·pot-1; Trt1:3 g urea·pot-1; Trt2:6 g urea·pot-1; Trt3:9 g urea·pot-1.The same below.

圖1不同類型突變體在不同氮肥處理下的表現(xiàn)型

Fig.1Differenttypesofmutantphenotypeunderdifferentnitrogenfertilizerlevels

表115個材料在不同水平氮肥處理下的表現(xiàn)型

Table1Phenotypesof15wheatlinesunderdifferentlevelsofnitrogentreatments

材料類型Materialtype材料名稱MaterialnameCKTrt1Trt2Trt3氮依賴型Nitrogen?dependent寧7840Ning7840HRLnon?HRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?3HRLHRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?4HRLHRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?5HRLHRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?6HRLnon?HRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?7HRLnon?HRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?8HRLnon?HRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?9HRLnon?HRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?10HRLnon?HRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?11HRLnon?HRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?12HRLnon?HRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?13HRLnon?HRLnon?HRLnon?HRLNMu?HRL?14HRLnon?HRLnon?HRLnon?HRL非氮依賴型Nitrogen?independentNMu?HRL?1HRLHRLHRLHRLNMu?HRL?2HRLHRLHRLHRL

2.2 兩種類型突變體與植株含氮量和氮效率的關(guān)系

由圖2可知，不同類型突變體在同一氮肥水平下植株含氮量不同：非氮依賴型突變體在不同時期的器官含氮量都在每盆施3 g尿素的條件下達到最高(圖2a)，而氮依賴型突變體在不同時期的器官含氮量都隨著施氮量的增多而升高(圖2b)。氮依賴型植株成熟期穗部的含氮量極顯著低于非氮依賴型植株(P=0.006)。

此外，兩種類型突變體在不同時期器官的氮吸收利用效率和施氮量都呈負相關(guān)，拔節(jié)期的氮肥利用效率最高，成熟期次之(表2)。T測驗結(jié)果表明，兩種類型突變體間成熟期莖稈和葉片的氮肥吸收利用效率差異不顯著(P=0.64)，非氮依賴型突變體的穗部氮肥利用效率顯著高于氮依賴型突變體(P=0.02)。

a:非氮依賴型突變體；b:氮依賴型突變體。

a:Nitrogen-independent mutants；b:Nitrogen-dependent mutants.

圖2兩種類型突變體在不同時期的各個器官在不同氮肥處理水平下的含氮量

Fig.2Nitrogencontentsofdifferentorgansofthetwotypesofmutantsunderdifferentnitrogenlevelsatdifferentgrowthstages

表2兩種類型突變體在不同氮肥處理下的氮肥利用效率多重比較結(jié)果

Table2Multiplecomparisonofthenitrogenfertilizerabsorptionandutilizationefficiencyintwotypesofmutantsunderdifferentnitrogentreatments

突變體Mutant處理Treatment拔節(jié)期地上部分組織Abovegroundtissueatelongationstage成熟期莖稈和葉片Stalksandleavesatmaturationstage成熟期穗部Earatmaturationstage非氮依賴型Trt15．84±0．36a3．81±0．24a4．96±0．31aNitrogen?independentTrt23．29±0．27b1．85±0．12b1．36±0．14bTrt31．91±0．09c1．11±0．10c0．89±0．09c氮依賴型Trt17．38±0．42a3．29±0．32a2．46±0．23aNitrogen?dependentTrt23．98±0．19b1．69±0．19b1．17±0．15bTrt32．84±0．18c1．29±0．16c0．75±0．06b

表中平均值后不同字母代表處理間的差異在0.05水平上顯著。下同。

The different letters following the mean values indicate significant difference at 0.05 level.The same below.

2.3 兩種類型突變體與葉綠素含量的關(guān)系

對兩種類型突變體植株在不同氮肥水平處理下的葉綠素含量進行T測驗，結(jié)果表明，低氮條件下兩種突變體植株葉綠素含量的差異顯著，非氮依賴型植株的葉綠素含量顯著低于氮依賴型植株；雖然在每盆施9 g尿素條件下，非氮依賴型植株的葉綠素含量仍低于氮依賴型植株，但差異不顯著(表3)，且兩種突變體植株的葉綠素含量都隨著施氮量的增加呈上升趨勢。

相對而言，非氮依賴型植株的葉綠素含量隨氮肥水平的上升呈直線上升，增幅比氮依賴型植株大，對照與每盆施6 g和9 g尿素處理間差異顯著，三個施氮處理之間差異不顯著；氮依賴型植株的葉綠素含量在對照和每盆施3 g尿素處理之間的升幅最大，在每盆施3 g、6 g和9 g尿素處理間的上升幅度趨于平緩，且處理間差異不顯著。

表3相同氮肥水平下兩種類型突變體的SPAD值及其T測驗結(jié)果

Table3T-testresultsofSPADvaluebetweentwomutanttypesunderthesamenitrogenlevel

處理Treatment非氮依賴型SPAD值Nitrogen?independent氮依賴型SPAD值Nitrogen?dependentT值TvalueP值PvalueCK28．66±0．56a35．61±0．75a-3．29<0．01Trt133．54±0．84ab41．36±0．47b-3．39<0．01Trt238．28±0．75b42．39±0．85b-1．95<0．01Trt340．14±0．83b43．07±0．69b-1．360．18

2.4 兩種類型突變體的白粉病嚴重度

T測驗結(jié)果表明，非氮依賴型的白粉病嚴重度極顯著低于氮依賴型(T=-7.59，P=2.72E-13)。在相同尿素處理條件下，兩種突變體材料的白粉病嚴重度呈現(xiàn)不同的增長趨勢。在不施氮的條件下，非氮依賴型突變體免疫白粉病；隨著施氮量的增多，植株的白粉病嚴重度增加，每盆施3 g、6 g和9 g尿素處理下的植株白粉病嚴重度分別為5.64%、6.84%和7.25%(表4)。多重比較結(jié)果顯示，非氮依賴型突變體的白粉病嚴重度在對照和每盆施3 g尿素處理間的差異不顯著，但與每盆施6 g和9 g尿素處理間差異顯著，三個施氮處理間的差異不顯著。由此可見，雖然氮肥施用量的增多導致非氮依賴型小麥植株的白粉病嚴重度的加重，但在高氮條件下，非氮依賴型突變體依舊高抗白粉病。

表4兩種類型突變體在不同氮肥水平下的白粉病嚴重度

Table4Powderymildewseverityoftwomutanttypesunderdifferentnitrogenlevels

處理Treatment非氮依賴型Nitrogen?independent/%氮依賴型Nitrogen?dependent/%CK0．00±0．00a0．45±0．01aTrt15．64±0．01ab58．93±0．34cTrt26．84±0．06b49．76±0．26bTrt37．25±0．12b48．24±0．53b

不施氮的條件下，氮依賴型突變體也免疫白粉病，并且在施氮和不施氮處理間差異顯著。在施氮條件下，每盆施3 g與6 g、9 g尿素處理間差異顯著，而每盆施6 g和9 g尿素兩個處理之間差異不顯著。與非氮依賴型突變體不同的是，高氮條件下，氮依賴型植株由原來的免疫白粉病變?yōu)橹懈邪追鄄?。這些結(jié)果表明，在白粉病大流行的年份里，攜帶HRL性狀的突變體能夠有效地降低白粉病的發(fā)病率。

3 討 論

研究表明，小麥不同生長時期吸收累積的氮量不同，同一生長時期不同器官氮素積累量也有較大差異[22]；小麥吸收的氮素在各器官中的分配也隨著不同生育時期生長中心的轉(zhuǎn)移而變化[23]。本研究根據(jù)材料對氮肥的敏感性，將攜帶HRL突變體分為氮依賴型和非氮依賴型。值得探究的是，雖然兩種類型突變體在拔節(jié)期的地上部分和成熟期的莖稈的氮肥吸收利用效率差異不顯著，但是非氮依賴型突變體的成熟期穗部氮肥吸收利用效率顯著高于氮依賴型突變體。因此利用非氮依賴型突變體能夠有效地提高氮肥的利用率，減少環(huán)境污染。

光合效率是構(gòu)成作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一，葉綠素的含量決定了光合能力的強弱，提高作物的光合能力是作物增產(chǎn)的有效途徑。一般認為葉片上的壞死病斑會影響植株的光合作用，本研究也表明低氮條件下，非氮依賴型植株的葉綠素含量顯著低于氮依賴型植株，但在高氮條件下，兩種類型突變體的葉綠素含量無顯著差異。前人研究表明，植物的光合能力與植株體內(nèi)的氮素營養(yǎng)水平呈正相關(guān)[24]。我們的實驗結(jié)果也表明隨著施氮水平的提高，兩種類型突變體的葉綠素含量都呈上升趨勢。非氮依賴型突變體的葉綠素含量在高氮處理下仍舊表現(xiàn)出高增長率，但是氮依賴型突變體的葉綠素含量在高氮條件下增長趨于緩慢。

對攜帶HRL表型的寧7840的研究表明，白粉病的抗性與HRL表型相關(guān)聯(lián)，同時發(fā)現(xiàn)該表型受氮肥誘導，施用氮肥后該性狀消失。郭露芳等[25]研究顯示，在高氮水平下小麥白粉病病情指數(shù)顯著高于低氮水平，我們也發(fā)現(xiàn)隨著施氮量的增加，氮依賴性突變體的白粉病嚴重度隨之增加，使植株由原先的免疫白粉病變?yōu)橹懈邪追鄄?，當施氮量增加到一定水?約126 kg·hm-2)，白粉病嚴重度反而下降，造成這一現(xiàn)象的原因可能和HRL的信號路徑和氮代謝機理相關(guān)。本課題組之前的研究表明，在低氮條件下，攜帶HRL性狀的小麥品系P7001的葉片表達該性狀，并高抗白粉?。辉诔渥愕臈l件下該性狀消失，P7001對白粉病的抗性也顯著降低[26]，通過轉(zhuǎn)錄組測序的Pathway分析，植物與病原菌互作和植物激素信號傳導這兩條信號路徑與HRL性狀極顯著相關(guān)，而增施氮肥能夠降低作物的抗病性，氮肥的用量顯著影響植物內(nèi)源激素水平[27]，從而在高氮條件下影響HRL性狀的表達。Wang等[28]發(fā)現(xiàn)一個小麥類過敏反應突變體HRL3，能夠增強植株對白粉病的抗性，本研究也發(fā)現(xiàn)了兩個增強型的HRL突變體為非氮依賴型突變體，在高氮條件下該表型未受影響仍高抗白粉病，為培育廣譜抗性品種提供了新的資源。以上發(fā)現(xiàn)在白粉病病害大流行的年份能夠最大效益地降低白粉病的損失，且對環(huán)境無害，但作用機理目前尚不清楚。

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