李瑩淑，李金鳳，張一楊，崇英之，杜 瑩，李玉紅，鄭國(guó)穎，韓鐵生，馮福民

(華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 /河北省煤礦衛(wèi)生與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山 063000)

異煙肼(isoniazid，INH)作為抗結(jié)核治療方案中不可替代的首選藥物具有一定的肝毒性，能夠引起抗結(jié)核藥物性肝損傷(anti-tuberclosis drug-induced liver injury，ADLI)[1]。異煙肼通過(guò)Ⅰ相代謝酶細(xì)胞色素P450(CYP450)與Ⅱ相代謝酶谷胱甘肽(GSH)解毒，當(dāng)毒性代謝產(chǎn)物大量生成就會(huì)耗竭肝內(nèi)GSH，產(chǎn)生親電子基、自由基。研究表明過(guò)量的親電子基、自由基會(huì)激活JNK通路，造成凋亡指標(biāo)JNK、Bax增加，抗凋亡指標(biāo)Bcl2減少，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2]。所以藥物毒性代謝產(chǎn)物的積累和解毒過(guò)程取決于Ⅰ相、Ⅱ相酶之間的平衡[3]。已有研究證明CYP2E1、GSTP1基因CpG島甲基化和基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物性肝損傷有關(guān)，從遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)兩方面說(shuō)明CYP2E1、GSTP1兩個(gè)基因與ADLI有關(guān)[4-6]。組蛋白乙?；瘜儆诒碛^遺傳學(xué)的研究范圍，研究表明異煙肼給藥3 d后大鼠肝臟HAT活性降低，HDAC活性升高[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究異煙肼、乙酰化酶抑制劑Garcinol及去乙?；敢种苿㏕SA引起的肝細(xì)胞組蛋白乙?；礁淖儗?duì)藥物代謝酶CYP2E1、GSTP1表達(dá)的影響，為有效預(yù)防及治療ADLI提供新的參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人正常肝細(xì)胞HL-7702購(gòu)自上海中科院。用含90%RPMI 1640(CORNING)、10%胎牛血清(CLARK)、1%雙抗的培養(yǎng)液作為HL-7702細(xì)胞的培養(yǎng)基，細(xì)胞放置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2儀器與試劑 異煙肼(日本TCI公司)，Garcinol(Cayman公司)，TSA(TCI公司)，二甲基亞砜(DMSO，TCI公司)，TRI Pure Reagent 總RNA抽提試劑盒(北京百泰克公司)，Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，HAT酶活性試劑盒、HDAC酶活性試劑盒、CYP2E1蛋白含量試劑盒、GSTP1蛋白含量試劑盒(北京綠源大德生物科技有限公司)。Heraeus高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Thermo Scientific公司)C1000PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems 公司)，CA94089型連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices分子儀器公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于6孔板上，每孔2 mL，分為6組，分別為對(duì)照組、INH組、INH+Garcinol組、Garcinol組、INH+TSA組、TSA組，每組6個(gè)副孔于6孔板中培養(yǎng)24 h后分別加入藥物和抑制劑，藥物濃度為800 g/L，Garcinol濃度為5 μmol/L，TSA濃度為1 μmol/L。3 h后收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2肝功能指標(biāo)ALT、AST水平的檢測(cè) 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照ALT、AST檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定各指標(biāo)水平。

1.3.3肝細(xì)胞HAT、HDAC酶活性檢測(cè) 收集細(xì)胞離心后棄上清液，加入細(xì)胞裂解液4 ℃震蕩20 min，14 000 r/min離心15 min取上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)HAT、HDAC活性。

1.3.4肝細(xì)胞CYP2E1、GSTP1、JNK、Bax、Bcl-2 mRNA檢測(cè) 收集細(xì)胞，常規(guī) TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以GAPDH為內(nèi)參，用 來(lái)表示各RNA的相對(duì)表達(dá)量。引物均由上海生工合成，其序列見(jiàn)表1，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 min;定量PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.5肝細(xì)胞CYP2E1、GSTP1蛋白檢測(cè) 收集細(xì)胞離心棄上清液，加入細(xì)胞裂解液4 ℃震蕩20 min，14 000 r/min離心15 min取上清液，CYP2E1 和GSTP1 蛋白含量采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

表1 擴(kuò)增基因和引物序列

2 結(jié) 果

2.1INH、Garcinol及TSA對(duì)肝細(xì)胞ALT、AST的影響 INH組與對(duì)照組相比ALT、AST酶活性增加(P<0.05)，Garcinol組、TSA組分別與對(duì)照組ALT、AST酶活差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示異煙肼造成肝細(xì)胞損傷，Garcinol與TSA對(duì)肝細(xì)胞無(wú)影響；INH+Garcinol與INH組相比ALT、AST酶活性降低(P<0.05)；INH+TSA與INH組相比ALT、AST酶活性降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與INH組比較

圖1各組細(xì)胞上清液中ALT、AST含量比較

2.2INH及抑制劑對(duì)肝細(xì)胞HAT活性和HDAC活性的影響 與對(duì)照組相比INH組肝細(xì)胞HAT活性降低(P<0.05)，Garcinol組肝細(xì)胞HAT活性降低(P<0.05)(圖2A)，與對(duì)照組相比INH組肝細(xì)胞HDAC活性增加(P<0.05)，TSA組HDAC活性降低(P<0.05)(圖2B)，提示INH影響肝細(xì)胞乙酰化的平衡，且Garcinol與TSA對(duì)HAT、HDAC分別有抑制作用；INH+Garcinol組與INH組比HAT活性降低(P<0.05)(圖2A)。INH+TSA組與INH組比HDAC活性降低(P<0.05)(圖2B)。

A：各組細(xì)胞HAT活性比較；B：各組細(xì)胞HDAC活性比較；a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與INH組相比

圖2各組細(xì)胞上清液中HAT、HDAC酶活性比較

2.3INH及抑制劑對(duì)肝細(xì)胞CYP2E1、GSTP1 mRNA和蛋白含量的影響 INH組與對(duì)照組比較CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)量均增加(P<0.05)，GSTP1 mRNA和蛋白表達(dá)量均減少(P<0.05)，INH+Garcinol組與INH組比CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)量都減少(P<0.05)，GSTP1 mRNA和蛋白表達(dá)量均減少(P<0.05)其他組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。INH+TSA組與INH組比CYP2E1mRNA和蛋白表達(dá)量均增加(P<0.05)，GSTP1 mRNA和蛋白表達(dá)量均增加(P<0.05)，TSA能逆轉(zhuǎn)INH導(dǎo)致的GSTP1降低，但也使INH導(dǎo)致升高的CYP2E1繼續(xù)增加，見(jiàn)圖3。

2.4INH、Garcinol及TSA對(duì)肝細(xì)胞JNK、Bax、Bcl2 mRNA的影響 INH組與對(duì)照組相比JNK mRNA、

A：CYP2E1；B：CYP2E1 mRNA；C：GSTP1；D：GSTP1 mRNA；a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與INH組比較

圖3各組CYP2E1 mRNA、CYP2E1蛋白、GSTP1 mRNA、GSTP1蛋白比較

Bax mRNA增加，Bcl2 mRNA減少(P<0.05)，INH+Garcinol組與INH+TSA組分別與INH組相比JNK mRNA、Bax mRNA減少(P<0.05)，Bcl2 mRNA增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與INH組相比。

圖4各組JNK mRNA、Baxm RNA、Bcl-2 mRNA水平比較

3 討 論

組蛋白乙?；揎検莿?dòng)態(tài)可逆的，HAT和HDAC共同調(diào)節(jié)，HAT通過(guò)將乙酰輔酶A上的乙酰基轉(zhuǎn)移到組蛋白氨基端特定的賴氨酸殘基上完成乙?；揎梉8-10]。在藥物性肝損傷的研究中，組蛋白乙?；蛔C實(shí)參與到肝損傷的發(fā)生過(guò)程中[11]。本研究發(fā)現(xiàn)INH作用肝細(xì)胞3 h后肝損傷指標(biāo)ALT、AST增加，同時(shí)HAT活性降低HDAC活性增加，這與本團(tuán)隊(duì)之前在大鼠實(shí)驗(yàn)中的出的結(jié)論一致。研究報(bào)道Garcinol對(duì) LPS/D-Gal 誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用，這一保護(hù)效應(yīng)不伴隨有肝內(nèi)炎癥因子的表達(dá)降低，可能通過(guò)抑制 p53 的乙?；揎?、降低其活性，從而下調(diào)促凋亡蛋白Bax、抑制肝細(xì)胞凋亡[12]。TSA是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，能使肝癌細(xì)胞CYP2E1表達(dá)增加促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)中Garcinol與TSA分別對(duì)HAT與HDAC活性有抑制作用。

CYP2E1和GSTP1為Ⅰ、Ⅱ相藥物代謝酶CYP450和GST家族的重要成員，研究已發(fā)現(xiàn)，其基因多態(tài)性與ADLI有關(guān)，可以作為疾病診斷及預(yù)后的潛在分子生物標(biāo)志物。CYP2E1在人肝臟中含量最為豐富[4-6]，并且富集于肝小葉中心區(qū)域，人類CYP2E1是細(xì)胞色素P450超家族中的重要成員之一，約占P450總量的7%左右[14-15]，參與多種藥物的代謝，大約有60%的藥物是由通過(guò)CYP450的作用清除的。GSTP1為體內(nèi)Ⅱ相物質(zhì)代謝酶，催化GSH與親電子物質(zhì)結(jié)合，將之轉(zhuǎn)化為親水性物質(zhì)，經(jīng)尿液或膽汁排出體外，這一過(guò)程為解毒反應(yīng)。本研究中INH致肝細(xì)胞CYP2E1 mRNA及蛋白增加，GSTP1 mRNA及蛋白減少，說(shuō)明INH可能改變Ⅰ、Ⅱ相藥物代謝酶的表達(dá)和翻譯，HAT活性降低HDAC活性增加可以抑制基因表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)中INH導(dǎo)致GSTP1降低，但CYP2E1表達(dá)增加，由于乙酰化酶家族和去乙?；易灏ê芏嗝?，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的總的HAT活性的變化是降低的，當(dāng)抑制HAT活性后CYP2E1的表達(dá)會(huì)降低，筆者推斷可能作用在CYP2E1基因啟動(dòng)子區(qū)的某種乙酰酶是升高的。

CYP450在抗結(jié)核藥物代謝肝臟解毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究報(bào)道CYP2E1可以通過(guò)其代謝產(chǎn)物自由基激活JNK通路導(dǎo)致凋亡進(jìn)而引起肝損傷[2]。本研究中INH組與對(duì)照組相比凋亡指標(biāo)JNK、Bax表達(dá)增加，抗凋亡指標(biāo)Bcl2表達(dá)減少說(shuō)明肝細(xì)胞發(fā)生了凋亡。INH+Garcinol組與INH+TSA組分別與INH組相比JNK、Bax表達(dá)減少，抗凋亡指標(biāo)Bcl2表達(dá)增加，說(shuō)明Garcinol與TSA均能逆轉(zhuǎn)凋亡。出現(xiàn)此變化可能由于Carcinol使CYP2E1和GSTP1表達(dá)均減少，降低INH代謝產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物；而TSA使CYP2E1和GSTP1表達(dá)均增加，促進(jìn)毒性代謝產(chǎn)物的代謝而解毒。

綜上所述，INH致肝損傷的原因可能是HAT與HDAC活性改變進(jìn)而影響藥物代謝酶CYP2E1、GSTP1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的改變。對(duì)于組蛋白乙?；侨绾尉唧w調(diào)控CYP2E1、GSTP1表達(dá)的機(jī)制仍需深入研究，為ADLI的預(yù)防和治療提供更詳盡的證據(jù)。

[1]JASWAL A,SINHA N,BHADAURIA M,et al.Therapeutic potential of thymoquinone against anti-tuberculosis drugs induced liver damage[J].Environ Toxicol Pharmacol,2013,36(3):779-786.

[3]YEW W W,LEUNG C C.Antituberculosis drugs and hepatotoxicity[J].Respirology,2006,11(6):699-707.

[2]SCHATTENBERG J M,CZAJA M J.Regulation of the effects of CYP2E1-induced oxidative stress by JNK signaling[J].Redox Biol,2014(3):7-15.

[4]ZHANG J,ZHU X,LI Y,et al.Correlation of CpG island methylation of the cytochrome P450 2E1/2D6 genes with liver injury induced by Anti-Tuberculosis drugs:a nested Case-Control study[J].Int J Environ Res Public Health,2016,13(8):776.

[5]HE L,GAO L,SHI Z,et al.Involvement of cytochrome P450 1A1 and glutathione S-transferase P1 polymorphisms and promoter hypermethylation in the progression of anti-tuberculosis drug-induced liver injury:a case-control study[J].PLoS One,2015,10(3):e0119481.

[6]陳怡，郭梅，李世明，等．細(xì)胞色素P450 2E1基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥致肝損傷的關(guān)系[J]．中華傳染病雜志，2010，28(12)：748-752．

[7]朱凌妍，李玉紅，任琦，等．異煙肼致大鼠肝損傷使組蛋白H4低乙?；痆J]．中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2016，30(11)：1192-1197．

[8]GRAEFF J,TSAI L H.Histone acetylation:molecular mnemonics on the chromatin[J].Nat Rev Neurosci,2013,14(2):97-111.

[9]YUN M Y,WU J,WORKMAN J L,et al.Readers of histone modifications[J].Cell Res,2011,21(4):564-578.

[10]LI B,CAREY M,WORKMAN J L.The role of chromatin during transcription[J].Cell,2007,128(4):707-719.

[11]MURATA K,HAMADA M,SUGIMOTO K,et al.A novel mechanism for drug-induced liver failure:inhibition of histone acetylation by hydralazine derivatives[J].J Hepatol,2007,46(2):322-329.

[12]JING Y,AI Q,LIN L,et al.Protective effects of garcinol in mice with lipopolysaccharide/D-galactosamine-induced apoptotic liver injury[J].Int Immunopharmacol,2014,19(2):373-380.

[13]YANG H,NIE Y,LI Y,et al.Histone modification-mediated CYP2E1 gene expression and apoptosis of HepG2 cells[J].Exp Biol Med (Maywood),2010,235(1):32-39.

[14]TAO N N,ZHOU H Z,TANG H,et al.Sirtuin 3 enhanced drug sensitivity of human hepatoma cells through glutathione S-transferase pi 1/JNK signaling pathway[J].Oncotarget,2016,7(31):50117-50130.

[15]JORGENSEN R A,CLUSTER P D,ENGLISH J,et al.Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers:comparison of sense vs.antisense constructs and single-copy vs.complex T-DNA sequences[J].Plant Mol Biol,1996,31(5):957-973.