余 利，冉 莉，喻 瑾，汪小蘭，郎和東，周 敏，王 斌，易 龍，糜漫天

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)營養(yǎng)與食品安全研究中心/重慶市醫(yī)學(xué)營養(yǎng)研究中心/重慶市營養(yǎng)與食品安全重點實驗室，重慶 400038)

隨著國民生活水平提高，生活方式和飲食結(jié)構(gòu)改變，非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發(fā)病率呈顯著上升趨勢，發(fā)病年齡日趨年輕化。NAFLD是以肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為特征的臨床病理綜合征，后期可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化及肝功能衰竭等系列肝臟損害，并且與糖尿病、動脈粥樣硬化性心血管疾病等發(fā)生密切相關(guān)[1]。目前，國內(nèi)外NAFLD的臨床診斷主要依據(jù)病理學(xué)和影像學(xué)檢測，但影像學(xué)檢測價格較高，病理學(xué)活檢風(fēng)險較大，因此，尋找敏感的血清學(xué)檢測指標對于快速診斷NAFLD十分必要。NAFLD的發(fā)病機制復(fù)雜，研究表明代謝失衡、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等均參與NAFLD疾病病程。本研究旨在通過人群研究，檢測血清中與NAFLD發(fā)生密切相關(guān)的多個維生素和抗氧化指標的水平及檢測指標間的相關(guān)性，同時考察不同檢測方法對部分檢測指標的影響，篩選發(fā)現(xiàn)可能作為NAFLD診斷的敏感血清學(xué)指標，為NAFLD的診斷、預(yù)防和治療提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年9-12月于本院體檢中心體檢的患者共806例。NAFLD納入標準：符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制訂的NAFLD診斷標準(2010年修訂版)[2]。排除標準：過量飲酒或肝炎病毒感染；胃腸道疾病，各種嚴重的慢性疾病或肝腎功能不全，惡性腫瘤；近1個月內(nèi)曾患有急慢性感染性疾病、創(chuàng)傷或手術(shù)；妊娠或哺乳期婦女。最終納入80例NAFLD患者為NAFLD組，其中男60例，女20例，年齡28～68歲，平均(46.89±9.35)歲。選取同時期體檢的，與NAFLD患者年齡、性別相匹配的健康人群為健康對照組，均無代謝綜合征表現(xiàn)，肝臟超聲和肝功能均正常。健康對照組最終入選80例，其中男62例，女18例，年齡23～68歲，平均(45.35±11.87)歲。本研究獲陸軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1檢測指標及方法 采集人群血樣。清晨采集受試者空腹靜脈血5～10 mL，靜置1 h，經(jīng)3 000 r/min離心10 min，分離取血清待測。NAFLD患者血清維生素檢測指標包括：維生素A(vitamin A，VA，酶聯(lián)免疫吸附法)、維生素D(vitamin D，VD，分別采用酶聯(lián)免疫吸附法和酶供體競爭法)、維生素E(vitamin E，VE，比色法)和維生素B12(vitamin B12，VB12，酶聯(lián)免疫吸附法)、血清視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，RBP，膠乳免疫比濁法)。血清抗氧化指標包括：丙二醛(malonaldehyde，MDA，硫代巴比妥酸法)、超氧化物歧化物(superoxide dismutase，SOD，分別采用鄰苯三酚底物法和WST-1法)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH，微量酶標法)。所有指標試驗操作按說明書步驟進行，吸光度的測定均采用酶標儀進行檢測。健康對照組檢測指標為血清MDA和GSH。

1.2.2儀器與主要試劑 吸光度檢測采用SpectraMax?M2多功能酶標儀(Molecular Devices)進行。RBP試劑盒購于中生北控生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自上海通蔚生物科技有限公司；VE、MDA、SOD(WST-1法)和GSH檢測試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司；VD(酶供體競爭法)和SOD(鄰苯三酚低物法)試劑盒購自九強生物技術(shù)有限公司。

1.3各指標正常參考值 RBP：25～70 mg/L[3]，VA：大于1.05 μmol/L[4]，VD(酶供體競爭法)：8～60 ng/mL[5]，VE：5～20 μg/mL[6]，VB12：88.8～133.2 ng/L[7]，SOD(鄰苯三酚底物法)：129～216 U/mL[8]。樣本值小于正常參考值則為缺乏，所占百分率為缺乏率。

2 結(jié) 果

2.1NAFLD患者血清維生素與抗氧化指標檢測結(jié)果 因人群血清樣本采集量有限，同一血清樣本不能完成所有指標的檢測，因此各檢測指標的實際樣本數(shù)有所差異。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常參考值比較，NAFLD患者RBP缺乏率為11.6%；VA缺乏率(缺乏+邊緣缺乏)為38.4%；VD(酶供體競爭法)缺乏率為7.9%；VE缺乏率高達86.0%；SOD缺乏率為27.9%，VB12無缺乏。NAFLD組與健康對照組血清MDA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.617，P=0.539)，但NAFLD組血清GSH水平明顯低于健康對照組(t=-4.681,P=0.001)，見表1、2。

表1 NAFLD組血清維生素與抗氧化指標檢測結(jié)果

表2 NAFLD患者組與健康對照組血清抗氧化指標檢測結(jié)果

2.2NAFLD患者血清學(xué)指標的不同測定方法一致性分析 采用酶聯(lián)免疫法和酶供體競爭法兩種方法檢測血清VD的水平，檢測值分別為616.7(370.3,1 067.0)ng/mL和(62.66±32.05)ng/mL，兩組檢測值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-9.341，P=0.001)，且一致性檢驗結(jié)果顯示兩種方法之間無相關(guān)性(ICC=0.000，P=0.501)。

采用鄰苯三酚底物法和WST-1兩種方法檢測血清SOD水平，檢測值分別為(138.61±23.53)U/mL和(58.01±12.99)U/mL，兩組檢測值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.495，P=0.002)，且一致性檢驗結(jié)果顯示兩種方法之間無相關(guān)性(ICC=-0.777，P=0.987)。

3 討 論

目前國內(nèi)外公認的NAFLD診斷標準主要包括3個方面：(1)組織學(xué)或影像學(xué)檢測出肝臟脂肪變性；(2)無飲酒史或飲酒量在標準之內(nèi)(每周飲酒量男性小于140 g，女性小于70 g)；(3)排除導(dǎo)致脂肪肝的慢性肝病因素，如病毒性肝炎、自身免疫性肝臟疾病及代謝性或遺傳性肝病等。然而，臨床上對NAFLD患者最常見的診斷方法還是超聲檢測，同時結(jié)合血清生化指標(血糖、血脂和轉(zhuǎn)氨酶等)，但是超聲檢測價格較高，而單一的血清學(xué)指標并不敏感和準確。近年對NAFLD發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)代謝失衡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等參與NAFLD發(fā)生、發(fā)展，因此，是否能夠?qū)⒍鄠€血清學(xué)指標特別是營養(yǎng)素、抗氧化指標等作為常規(guī)檢測指標納入NAFLD的診斷標準，以提供NAFLD的診斷準確率，值得研究。本研究提示，血清維生素VA和VE及抗氧化指標SOD、GSH在NAFLD患病人群中的血清水平明顯降低，提示以上指標對NAFLD的臨床診斷具有重要意義。

3.1NAFLD患者血清維生素指標 目前國內(nèi)有關(guān)成人VA營養(yǎng)狀況研究很少，有限的研究多集中于城市居民，且結(jié)果差異較大。本研究中血清VA水平普遍低于同類研究[9]，提示NAFLD患者血清VA較低，在其早期篩查診斷時可考慮納入該指標。

血清VD水平是判斷人體VD狀態(tài)的主要依據(jù)，全球人口VD水平平均為20.8 ng/mL[10]，VD缺乏或不足在中國普通人群很常見[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，VD的抗炎、抗氧化及抗纖維化效應(yīng)可能參與了NAFLD的發(fā)病及發(fā)展[12]。但有關(guān)VD與NAFLD發(fā)生、發(fā)展的臨床研究資料較少且研究結(jié)果尚存分歧，盡管存在爭議，最近的一篇Meta分析仍顯示，VD缺乏可能在NAFLD的發(fā)生和進展中起一定的作用[13]。因此，關(guān)注NAFLD危險人群的VD水平，對NAFLD早期預(yù)防有重要意義。

在NAFLD的發(fā)生過程中，肝細胞變性壞死，激活吞噬細胞和炎性反應(yīng)，引起呼吸爆發(fā)和細胞崩解而產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基、羥自由基等，機體為清除過量的自由基，消耗大量VE等抗氧化劑，導(dǎo)致其水平顯著降低[14]。本研究中NAFLD患者血清VE水平低于楊燕[15]、張岱[16]的研究，且僅14%的NAFLD患者VE水平處于正常范圍值。即不同程度的肝細胞病變狀態(tài)下，血清VE水平低于健康人群。

3.2NAFLD患者血清抗氧化指標 本研究中NAFLD患者的GSH水平較健康對照組明顯降低。GSH是內(nèi)源性抗氧化劑，是衡量機體抗氧化能力的重要因素，研究顯示，在NAFLD患者中，反映氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化程度的指標GSH、GSH/GSSG明顯降低，GSSG、MDA明顯升高，提示NAFLD患者存在脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激狀態(tài)[17]。NAFLD患者的血清MDA可一定程度上反映脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激狀態(tài)，SOD活性作為反映抗氧化能力指標之一[18]，NAFLD患者的MDA和SOD水平及活性狀態(tài)應(yīng)該納入NAFLD危險人群體檢的早期指標體系中。

3.3不同檢測方法的一致性 本研究采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(評價一致性的理想指標，它對系統(tǒng)誤差和隨機誤差均敏感[19])對兩種檢測方法的結(jié)果進行一致性分析。血清VD采用ELISA法和酶供體競爭法測定，組內(nèi)相關(guān)系數(shù)未顯示出相關(guān)性，且ELISA方法檢測的VD水平遠超出正常值，而酶供體競爭法檢測的VD水平與王天寶等[20]2013年研究結(jié)果相比，水平基本在正常范圍內(nèi)；賈新轉(zhuǎn)[21]研究顯示，中國北方健康人群血清總25羥維生素(25OHD)水平為1.67～44.80 ng/mL，均值為(18.80±6.65)ng/mL。因此酶供體競爭法能較好地反映人體血清VD的水平。

經(jīng)北京地區(qū)120例健康人群樣本驗證，采用鄰苯三酚底物法測定SOD的正常參考值范圍為110～215 U/mL，本研究結(jié)果基本在正常值范圍內(nèi)。而采用WST-1法測定的SOD值不在該參考范圍內(nèi)，一致性分析顯示，兩種方法無相關(guān)性。因此，鄰苯三酚底物法能更好地反映血清SOD的水平，且鄰苯三酚底物法試劑盒是用于自動生化分析儀檢測的，能更好地避免人工加樣產(chǎn)生的誤差，更適用于大樣本的人群血清SOD水平檢測分析。

綜上，NAFLD患者血清維生素指標VA、VE、GSH和SOD水平的改變，表明其抗氧化能力降低，可能導(dǎo)致肝細胞的進一步損傷。因此，由這些指標構(gòu)成的指標體系可能進一步豐富NAFLD臨床診斷標準，對NAFLD的臨床診斷具有重要意義，同時應(yīng)當選擇合適的檢測方法。

[1]李靜，周利霞，王俊明，等．石家莊地區(qū)體檢人群非酒精性脂肪性肝病患病情況及危險因素分析[J]．第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2012，33(8)：879-884．

[2]范建高．非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)[J]．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，19(5)：641-644．

[3]鄒燕，鄭春蘇，羅慧屏，等．免疫透射比濁法測定成人血清視黃醇結(jié)合蛋白的參考值建立[J]．中國醫(yī)學(xué)裝備，2012，9(7)：10-13．

[4]CASTEJON H V,ORTEGA P,AMAYA D,et al.Co-existence of anemia,vitamin A deficiency and growth retardation among children 24-84 months old in Maracaibo,Venezuela[J].Nutr Neurosci,2004,7(2):113-119.

[5]STROUD M L,STILGOE S,STOTT V E,et al.Vitamin D:a review[J].Aust Fam Physician,2008,37(12):1002.

[6]Institute of Medicine (US) Panel on Dietary Antioxidants and Related Compounds.Dietary reference intakes for vitamin c,vitamin e,selenium,and carotenoids[M].Washington(DC):National Academies Press,2000:106-109.

[7]CHATTHANAWAREE W.Biomarkers of cobalamin (vitamin B12) deficiency and its application[J].J Nutr Health Aging,2011,15(3):227-231.

[8]嚴海燕，勞偉思，鐘日輝，等．鄰苯三酚法檢測血清超氧化物歧化酶參考值范圍的驗證和建立[J]．實用醫(yī)技雜志，2010，17(12)：1144-1145．

[9]孫煒，朱暉，刁娟娟，等．烏魯木齊市不同性別成年人血清中維生素A、E測定與分析[J]．中國初級衛(wèi)生保健，2012(6)：44-46．

[10]HAGENAU T,VEST R,GISSEL T N,et al.Global vitamin D levels in relation to age,gender,skin pigmentation and latitude:an ecologic meta-regression analysis[J].Osteoporos Int,2009,20(1):133-140.

[11]LU L,YU Z,PAN A,et al.Plasma 25-hydroxyvitamin D concentration and metabolic syndrome among middle-aged and elderly Chinese individuals[J].Diabetes Care,2009,32(7):1278-1283.

[12]KITSON M T,ROBERTS S K.D-livering the message:the importance of vitamin D status in chronic liver disease[J].J Hepatol,2012,57(4):897-909.

[13]ELIADES M,SPYROU E,AGRAWAL N,et al.Meta-analysis:vitamin D and non-alcoholic fatty liver disease[J].Aliment Pharmacol Ther,2013,38(3):246-254.

[14]張志成，張文武，馮婉玉．HPLC法比較非酒精性脂肪性肝病患者和正常人血漿中維生素E水平[J]．沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2009(B07)：23-25．

[15]楊燕．肝病患者血清維生素 E 水平檢測及臨床意義[J]．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2003，19(6)：684-685．

[16]張岱．肝硬化患者血清維生素 E 水平與肝纖維化及肝功能指標的對比分析[D]．沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)，2010．

[17]韓昕晶，沈薇．非酒精性脂肪肝患者血清脂聯(lián)素水平及其與氧化應(yīng)激的相關(guān)性研究[J]．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24(14)：2069-2070．

[18]蔣興亮，張均，劉素蘭，等．非酒精性脂肪肝患者氧化應(yīng)激和抗氧化酶狀態(tài)[J]．四川醫(yī)學(xué)，2009，30(12)：1958-1960．

[19]李鎰沖，李曉松．兩種測量方法定量測量結(jié)果的一致性評價[J]．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34(17)：3263-3266．

[20]王天寶，嵇興梅，都健，等．健康體檢人群血清25-羥基維生素D水平與非酒精性脂肪肝的相關(guān)性[J]．中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志，2013，6(2)：121-125．

[21]賈新轉(zhuǎn),魏蘭.血清25OHD水平與精液參數(shù)的關(guān)系[J]．天津醫(yī)藥，2015，43(7)：762-765．