齊興菊，馮 杰

(貴州省人民醫(yī)院兒科，貴陽(yáng) 550002)

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)是兒童期常見的惡性腫瘤，發(fā)病數(shù)占兒童惡性腫瘤的25%～35%[1]。絕大多數(shù)ALL患兒?jiǎn)渭円揽炕熅湍塬@得長(zhǎng)期的無(wú)病生存狀態(tài)[2-3]。甲氨蝶呤(MTX)、6-巰基嘌呤(6-MP)是治療兒童ALL的重要化療藥物，但其不良反應(yīng)會(huì)影響患兒化療的順利進(jìn)行。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝中的限速酶，巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(TPMT)是6-MP代謝分解的重要酶之一。二者單核苷酸基因多態(tài)性(SDP)對(duì)于MTX及6-MP化療的不良反應(yīng)有一定相關(guān)性[4-5]。對(duì)MTHFR及TPMT單核苷酸基因多態(tài)性(SDP)的研究，可以為ALL患兒個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年1月至2016年10月在本院兒內(nèi)血液科確診并住院治療的漢族ALL患兒98例為研究對(duì)象。其中，男64例，女34例，年齡(5.36±2.14)歲。所有ALL患兒的診斷均符合全國(guó)兒童ALL診療建議[6]。根據(jù)臨床危險(xiǎn)度對(duì)患兒分組[7]:高危組16例，男11例，女5例，年齡(6.03±2.26)歲；中危組39例，男27例，女12例，年齡(5.94±2.64)歲；標(biāo)危組43例，男26例，女17例，年齡(5.76±2.38)歲?；純航?jīng)前期強(qiáng)化及鞏固治療都已達(dá)完全緩解后進(jìn)入維持治療。本研究獲醫(yī)院倫理評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒家長(zhǎng)均知情同意。

1.2方法

1.2.1治療方案 根據(jù)兒童CCLG-ALL2008方案，全部患兒均行大劑量(HD)-MTX+醛氫葉酸(CF)+6-MP方案化療，MTX行24 h靜脈滴注，先以10%突擊劑量在0.5 h內(nèi)快速靜滴，其余90%在23.5 h內(nèi)均勻滴入。中危與高危組MTX劑量為5 g/m2，標(biāo)危組為3 g/m2。突擊量MTX滴后2 h內(nèi)，中危與高危組以MTX、地塞米松及阿糖胞苷等三聯(lián)藥物進(jìn)行1次鞘內(nèi)注射，標(biāo)危組以MTX進(jìn)行1次鞘內(nèi)注射。MTX開始42 h后以劑量為15 mg/m2的CF解救，給藥間隔為6 h，給藥頻次為6～8次。HD-MTX前5 d以大劑量水化堿化(液體總量如下：中高危3 000～4 000 mL·m-2·d-1，標(biāo)危2 000～3 000 mL·m-2·d-1，總堿量130 mL·m-2·d-1)。與此同時(shí)，每天臨睡前頓服6-MP 25 mg/m2。治療期間監(jiān)測(cè)24 h水量出入，并使尿pH值維持在7.0～8.0?；煏r(shí)常規(guī)保護(hù)重要臟器、胃腸道與口腔黏膜。

1.2.2基因分型檢測(cè)

1.2.2.1主要試劑與儀器 QIAamp RNA Blood Mini Kit試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，Reverse Transcriptase XL逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連Takara公司，瓊脂糖購(gòu)自西班牙Pharmerisco公司，所有引物均由華大基因科技公司合成。主要儀器為梯度PCR檢測(cè)儀(德國(guó)Biometra公司)、核酸電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2.2.2RNA提取及cDNA制備 抽取患兒外周血2 mL，EDTA抗凝并于-70 ℃保存。使用QIAamp RNA試劑盒提取總RNA，并采用Reverse Transcriptase XL逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，均按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.2.3引物設(shè)計(jì) 自Genbank獲取MTHFR及TPMT的核苷酸序列，MTHFR C677T、MTHFR A1298C的引物設(shè)計(jì)依據(jù)伍艷鵬等[8]文獻(xiàn)，TPMT A719G、TPMT G460A 的引物設(shè)計(jì)分別參照ASHAVAID等[9]與ZHANG等[10]的文獻(xiàn)。

1.2.2.4PCR擴(kuò)增 MTHFR C677T與MTHFR A1298C的總反應(yīng)體系為50.00 μL：去離子水17.00 μL,正向與反向引物(10 μmol/L)各2.00 μL,Mix(2×)25.00 μL,DNA模板4.00 μL。反應(yīng)條件均為：95 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)；之后72 ℃ 延伸5 min。TPMT A719G、TPMT G460A的總反應(yīng)體系為50.00 μL：去離子水35.75 μL、正向與反向引物(10 μmol /L)各1.00 μL,dNTP Mix 4.00 μL,Taq 0.25 μL,緩沖液8.00 μL。反應(yīng)條件均為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；之后72 ℃ 延伸4 min。

1.2.2.5PCR產(chǎn)物電泳及測(cè)序 取待測(cè)PCR產(chǎn)物5.0 μL及Marker 7.5 μL，加入3%瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，電泳60 min，電壓為60 mV，凝膠成像系統(tǒng)拍照。有異常條帶的樣本原液送華大基因科技公司純化后直接測(cè)序。

1.2.3不良反應(yīng)評(píng)價(jià) 參照美國(guó)國(guó)立癌癥研究所常規(guī)毒性判定標(biāo)準(zhǔn)(NCI-CTC)[11]記錄研究對(duì)象化療過(guò)程中發(fā)生的不良反應(yīng)，觀察指標(biāo)為:黏膜損傷表現(xiàn)為口腔炎；胃腸道反應(yīng)以腹瀉、嘔吐為主；肝臟毒性主要表現(xiàn)為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶及天門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶升高；骨髓抑制主要以血小板及血紅蛋白下降，外周血中性粒細(xì)胞降低。分級(jí)大于Ⅱ級(jí)為化療不良反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1MTHFR基因型分布 98例ALL患兒MTHFR C677T位點(diǎn)：CC野生型33例(33.67%),CT雜合型46例(46.94%),TT純合型19例(19.39%)。A1298C位點(diǎn)：AA野生型54例(55.10%),AC雜合型32例(32.65%),CC純合型12例(12.24%)。C677T及A1298C各位點(diǎn)基因型在不同臨床分組中比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。ALL患兒MTHFR C677T和A1298C的突變率分別為66.33%和44.90%。

表1 ALL患兒各基因型分布[n(%)]

2.2TPMT基因型分布 98例ALL患兒TPMT A719G位點(diǎn)：AA野生型86例(87.76%),AG雜合型7例(7.14%)，GG純合型5例(5.10%)。TPMT G460A位點(diǎn)：GG野生型89例(90.82%)，GA雜合型5例(5.10%)，AA純合型4例(4.08%)。A719G及G460A各位點(diǎn)基因型在不同臨床分組中比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 ALL患兒TPMT A719G、G460A基因型分布[n(%)]

2.3MTHFR基因型與化療不良反應(yīng)的關(guān)系 98例ALL患兒中，出現(xiàn)血小板減少、血紅蛋白降低和中性粒細(xì)胞減少的分別有14例(14.29%)，51例(52.04%)和78例(79.59%)，發(fā)生黏膜損傷25例(25.51%)，肝臟毒性21例(21.43%)及胃腸道反應(yīng)36例(36.73%)。C677T各SNP相關(guān)化療后不良反應(yīng)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);A1298AC出現(xiàn)血小板減少的比例(28.13%)高于A1298AA基因型(7.41%)與A1298CC基因型(8.33%)，A1298AA發(fā)生黏膜損傷的比例(9.26%)低于A1298AC基因型(43.75%)與A1298CC基因型(50.00%)，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余不良反應(yīng)與A1298C各SNP比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4TPMT基因型與化療不良反應(yīng)的關(guān)系 A719G各SNP相關(guān)化療后不良反應(yīng)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，G460A各SNP各相關(guān)不良反應(yīng)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表3 MTHFR C677T、A1298C基因多態(tài)性與化療后不良反應(yīng)的關(guān)系(n)

表4 TPMT A719G、G460A基因多態(tài)性與化療后不良反應(yīng)的關(guān)系(n)

3 討 論

隨著眾多基因的SNP位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，ALL患兒的用藥個(gè)體化與基因多態(tài)性的關(guān)系正日益得到關(guān)注，影響ALL患兒化療藥物代謝的基因多態(tài)性已被作為ALL化療不良反應(yīng)與預(yù)后的預(yù)測(cè)因素?？谷~酸劑MTX是治療ALL的重要藥物，MTX經(jīng)膜葉酸受體及還原葉酸載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，再經(jīng)合成酶催化多聚谷氨酸化形成MTXPGs，從而發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸還原酶(DHFR)的作用，使DNA復(fù)制所必需的dTMP合成受抑制而發(fā)揮抗腫瘤作用。MTHFR是葉酸代謝相關(guān)酶，能催化亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆臍淙~酸，其催化的代謝途徑能被MTX抑制，因而MTX的不良反應(yīng)及藥理作用與MTHFR的多態(tài)性關(guān)系密切[12]。6-MP是治療兒童ALL的抗嘌呤代謝藥物，通過(guò)抑制嘌呤合成途徑，競(jìng)爭(zhēng)性抑制次黃嘌呤的轉(zhuǎn)變，并阻礙DNA合成，使淋巴細(xì)胞增殖受到抑制，是維持治療的重要藥物，但6-MP必須經(jīng)過(guò)代謝生成硫鳥嘌呤核苷酸(TGNs)后才能發(fā)揮抗腫瘤活性。TPMT能將6-MP催化轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性的甲基化代謝物，從而降低穩(wěn)態(tài)TGNs水平。研究顯示對(duì)6-MP敏感性低的ALL患兒在使用標(biāo)準(zhǔn)劑量藥物后因抑制作用不充分而易復(fù)發(fā)，而敏感性高的患兒則易出現(xiàn)不良反應(yīng)，導(dǎo)致藥物效應(yīng)差異的主要原因是藥物代謝酶基因的差異[5]。TPMT是6-MP代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，其基因多態(tài)性與ALL患兒的個(gè)性化劑量及不良反應(yīng)也受到高度關(guān)注。

研究顯示，不同地區(qū)和種族的人群MTHFR、TPMT各SNP的突變情況及頻率有所不同。本研究結(jié)果表明，本地區(qū)ALL患兒MTHFR C677T和A1298C的突變率分別達(dá)66.33%和44.90%，與鄭苗苗等[13]、伍艷鵬等[8]研究相似。本研究TPMT A719G、G460A的突變率分別為12.24%及9.18%，高于謝茜等[5]及陳小文等[14]研究，提示中國(guó)不同地區(qū)人群可能具有特征性的基因變異。由于MTHFR在MTX與葉酸的代謝中起重要的作用，MTHFR C677T和A1298C 2個(gè)基因位點(diǎn)的變異可改變酶的活性，從而影響MTX的化療效應(yīng)[15]。目前對(duì)于MTHFR C677T和A1298C與MTX化療不良反應(yīng)的關(guān)系具有不同的觀點(diǎn)，LIU等[16]研究顯示677CT/TT基因型會(huì)使ALL患兒出現(xiàn)血小板降低的風(fēng)險(xiǎn)增加，而677TT基因型相對(duì)于677CC野生型，導(dǎo)致黏膜損害及肝臟毒性的風(fēng)險(xiǎn)也出現(xiàn)升高[17]。本研究顯示C677T各基因型出現(xiàn)MTX化療不良反應(yīng)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與鄭苗苗等[13]、廖清船等[18]研究一致。本研究發(fā)現(xiàn)A1298AC出現(xiàn)血小板減少的風(fēng)險(xiǎn)增加(P<0.05)，KANTAR等[19]研究顯示1298AC/CC基因型使肝毒性及骨髓抑制的風(fēng)險(xiǎn)上升。推測(cè)MTHFR A1298C多態(tài)性代謝過(guò)程中亞甲基四氫葉酸分流至DNA合成補(bǔ)救途徑較低，使DNA合成受到抑制，并在細(xì)胞內(nèi)與MTX共同抑制二氫葉酸轉(zhuǎn)化為四氫葉酸，阻斷胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸合成，從而導(dǎo)致較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)。但也有研究報(bào)道A1298C SNP與MTX不良反應(yīng)無(wú)顯著相關(guān)[20]。本研究顯示A1298AA出現(xiàn)黏膜損傷的風(fēng)險(xiǎn)下降(P<0.05)，與伍艷鵬等[8]研究一致。MTHFR A1298AA基因突變時(shí)可能將谷氨酸錯(cuò)譯為丙氨酸，并增加產(chǎn)生胸腺核苷酸酶作用物，可合成更多的DNA從而降低不良作用。本研究顯示，TPMT A719G、G460A各SNP與化療后不良反應(yīng)的出現(xiàn)均無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，與謝茜等[5]研究結(jié)果一致。提示不同地區(qū)的TPMT的基因多態(tài)性可能存在差異。此外，只對(duì)2個(gè)TPMT的位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)可能無(wú)法評(píng)價(jià)其與6-MP的不良反應(yīng)的關(guān)系。

綜上所述，MTHFR A1298C的基因多態(tài)性可能影響ALL患兒化療出現(xiàn)的不良反應(yīng)，臨床治療時(shí)可依據(jù)對(duì)MTHFR A1298C SNP的檢測(cè)預(yù)測(cè)患兒MTX化療后不良反應(yīng)。同時(shí)，可考慮對(duì)TPMT其他基因多態(tài)性進(jìn)一步檢測(cè)，明確TPMT與6-MP化療不良反應(yīng)的關(guān)系，以指導(dǎo)ALL患兒的個(gè)體化治療?？紤]到基因多態(tài)性對(duì)ALL化療可能具有的綜合影響，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行更加深入地研究。

[1]陳洋，夏江寶，何曉東，等．MTHFR基因多態(tài)性在MTX治療急性淋巴細(xì)胞白血病過(guò)程中毒性反應(yīng)的Meta分析[J]．中華疾病控制雜志，2015，19(8)：811-815．

[2]葉啟東，顧龍君.兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的個(gè)體化治療-TPMT和MTHFR基因多態(tài)性[J]．中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2016，31(4)：286-291.

[3]PUI C H,EVANS W E.Treatment of acute lymphoblastic leukemia[J].N Engl J Med,2006,354(2):166-178.

[4]D′ANGELO V,RAMAGLIA M,IANNOTTA A,et al.Methotrexate toxicity and efficacy during the consolidation phase in paediatric acute lymphoblastic leukaemia and MTHFR polymorphisms as pharmacogenetic determinants[J].Cancer Chemother Pharmacol,2011,68(5):1339-1346.

[5]謝茜，肖劍文，憲瑩，等．巰嘌呤治療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)不良反應(yīng)及其與TPMT基因多態(tài)性關(guān)系的研究[J]．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，36(7)：777-781．

[6]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)血液組．兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第三次修訂草案)[J]．中華兒科雜志，2006，44(5)：392-395．

[7]LUO X Q,KE Z Y,GUAN X Q,et al.The comparison of outcome and cost of three protocols for childhood non-high risk acute lymphoblastic leukemiain China[J].Pediatr Blood Cancer,2008,51(2):204-209.

[8]伍艷鵬，賀湘玲，鄒潤(rùn)英，等．急性淋巴細(xì)胞白血病患兒 MTHFR 基因多態(tài)性與大劑量甲氨蝶呤化療后不良反應(yīng)的關(guān)系[J]．廣東醫(yī)學(xué)，2015，36(3)：413-416．

[9]ASHAVAID T F,RAGHAVAN R,SHAH S,et al.TPMT and DPD polymorphisms:efficient screening method for Indian patients considering taking Thiopurine and 5-FU drugs[J].Dis Markers,2009,27(5):231-238.

[10]ZHANG L R,SONG D K,ZHANG W,et al.Efficient screening method of the thiopurine methyltransferase polymorphisms for patients considering taking thiopurine drugs in a Chinese Han population in Henan Province (central China)[J].Clin Chim Acta,2007,376(1/2):45-51.

[11]謝偲，岳麗杰，丁慧，等．6-巰基嘌呤致急性淋巴細(xì)胞白血病患兒不良反應(yīng)及其與TPMT基因多態(tài)性的關(guān)系[J]．中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2014，16(5)：499-503．

[12]FRENCH D,YANG W J,CHENG C,et al.Acquired variation outweighs inherited variation in whole genome analysis of methotrexate polyglutamate accumulation in leukemia[J].Blood,2009,113(19):4512-4520.

[13]鄭苗苗，岳麗杰，陳小文，等．急性淋巴細(xì)胞白血病患兒MTHFR基因多態(tài)性與大劑量甲氨蝶呤不良反應(yīng)的關(guān)系[J]．中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2013，15(3)：201-206．

[14]陳小文，岳麗杰，李成榮．白血病患兒和

健康兒童TPMT基因多態(tài)性檢測(cè)分析[J]．中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2009，26(4)：457-460．

[15]CHIUSOLO P,GIAMMARCO S,BELLESI S A,et al.The role of MTHFR and RFC1 polymorphisms on toxicity and outcome of adult patients with hematological malignancies treated with high-dose methotrexate followed by leucovorin rescue[J].Cancer Chem Pharmacol,2012,69(3):691-696.

[16]LIU S G,LI Z G,CUI L,et al.Effects of methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms on toxicities during consolidation therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia in a Chinese population[J].Leuk Lymphoma,2011,52(6):1030-1040.

[17]TANTAWY A A,EL-BOSTANY E A,ADLY A A,et al.Methylene tetrahydrofolate reductase gene polymorphism in Egyptian children with acute lymphoblastic leukemia[J].Blood Coag Fibr,2010,21(1):28-34.

[18]廖清船，李曉蕾，劉思婷，等．MTHFR基因多態(tài)性及單體型與大劑量甲氨蝶呤化療毒性反應(yīng)的相關(guān)性研究[J]．中華流行病學(xué)雜志，2012，33(7)：735-739．

[19]KANTAR M,KOSOVA B,CETINGUL N,et al.Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1298C gene polymorphisms and therapy-related toxicity in children treated for acute lymphoblastic leukemia and non-Hodgkin lymphoma[J].Leuk Lymphoma,2009,50(6):912-917.

[20]ER?ULJ N,KOTNIK B F,DEBELJAK M,et al.Influence of folate pathway polymorphisms on high-dose methotrexate-related toxicity and survival in childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Lymphoma,2012,53(6):1096-1104.