石 磊,趙 焱,徐治強,王建祥,彭 翔

(湖北省武漢市普愛醫(yī)院神經外科 430033)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)指腦實質的非創(chuàng)傷性出血，是一種嚴重危害人們健康的疾病，常發(fā)生于50歲以上患者，占急性腦血管病的20%～30%。我國每年因ICH死亡的人數高達100萬，在急性腦血管病中病死率最高[1]。無論保守治療還是手術治療，腦血管病病情的惡化均與ICH后腦水腫和繼發(fā)性腦損傷密切相關[2]。然而，目前尚缺乏有效的預防手段及治療腦水腫及繼發(fā)性腦損害的藥物。原花青素是一大類多酚化合物的總稱，具有強效的抗氧化作用，且具有抗炎、抗糖尿病、保護缺血性腦損傷、保護心血管等藥理作用，是極具發(fā)展前景的天然植物提取物[3]。本研究探討原花青素對ICH后腦水腫及繼發(fā)性腦損傷的影響及其機制，進一步明確原花青素的藥理作用及應用前景，為預防及治療ICH后繼發(fā)性腦損傷提供一定的實驗及理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：健康C57BL6雄性小鼠48只，體質量(250±30)g，由湖北省實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)室為屏蔽環(huán)境，控制室溫約為22 ℃，室內濕度約為55%。動物實驗過程符合實驗動物倫理學要求。試劑：原花青素(含量大于95%，Solarbio公司，中國)，膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體及小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白抗體(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba-1)抗體(Abcam公司，英國)，正置顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2方法

1.2.1動物模型分組及給藥 根據前期實驗摸索，原花青素濃度使用中濃度(100 mg/kg)比較合適。8月齡健康C57BL6雄性小鼠分為4組，Sham+生理鹽水組、Sham+原花青素(100 mg/kg)組、ICH+生理鹽水組、ICH+原花青素(100 mg/kg)組。4組小鼠分別灌胃給藥7 d后取材。

1.2.2ICH模型制備 C57BL6小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉后，暴露前囟，將小鼠放置于立體定位儀上，在前囟后0.2 mm，中線右3.0 mm處鉆孔，微量加樣器沿顱骨孔垂直進針6.0 mm，緩慢注入自體尾動脈血20 μL，對照組注入等量的生理鹽水。手術結束后記錄時間，各組小鼠正常飲食，分籠飼養(yǎng)。

1.2.3神經功能評分 觀察術后各組小鼠，Bederson法對神經功能進行初步評估[4]。Bederson法：輕抓尾巴，提起高于桌面10 cm，正常小鼠前爪伸直。0分：無神經功能缺損；1分：腦部病變對側腕關節(jié)、肘關節(jié)屈曲，肩內收屈曲；2分：上述體征+向麻痹側推阻力下降；3分：活動是向麻痹側打圈(追尾狀)。以造模后4、8、12、24 h為時間點，對各組小鼠進行神經功能評分。

1.2.4干濕比重法測定腦組織含水量 造模后24 h處死小鼠，在冰盤上斷頭取腦，用冰生理鹽水沖洗3次，洗去積血。迅速切取進針孔前半部分腦組織，精確稱重(0.1 mg)。然后將稱好的腦組織置于恒溫烘干箱中烘干，準確稱取干重。根據Elliott公式計算腦組織含水量：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.5蘇木素-伊紅(HE)染色 造模后24 h向小鼠腹腔注射4%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，迅速開腔，從右心耳先后灌注0.9%生理鹽水約150 mL，4%多聚甲醛約300 mL。待徹底灌注完成后，斷頭取腦，切取部分腦組織，進行組織包埋、切片及HE染色，顯微鏡下觀察出血區(qū)及周圍的神經細胞的形態(tài)改變。

1.2.6Western blot檢測 取各組小鼠腦海馬區(qū)組織，將其剪成細小碎片，按250 μL/20 mg將含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液加入碎片組織，使用勻漿器將其勻漿至完全裂解。然后將完全裂解的組織樣本置入4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液進行蛋白定量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)跑膠，然后轉膜，利用一抗GFAP抗體(1∶200)、Iba-1抗體(1∶1 000)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(1:500)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體(1∶500)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)抗體(1∶500)室溫孵育1 h后，磷酸鹽緩沖液吐溫20(phosphate buffered solution Tween-20,PBST)洗滌，用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗(1∶200)室溫孵育1 h，PBST洗滌3次。取適量電化學發(fā)光(ECL)發(fā)光液膜正面進行顯色處理后在化學發(fā)光分析儀中檢測。

1.2.7TUNEL染色 石蠟包埋的組織切片經脫蠟水化后，滴加蛋白酶K室溫孵育20 min后，加入50 μL TUNEL反應混合液，濕盒暗室中37 ℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，再加入50 μL轉化-POK，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加50 μL二氨基聯(lián)。

2 結 果

2.1原花青素對ICH小鼠神經功能的作用 術后Sham各組小鼠出現輕微不適，但沒有明顯神經功能缺損癥狀。ICH各組小鼠神經功能缺損癥狀比較嚴重，主要表現為前肢肘關節(jié)屈曲、不停地轉圈、偏癱，神經行為學評分比較有差異。在4 h時間點，ICH+原花青素組小鼠的神經行為學評分有所降低，但與Sham+原花青素組小鼠相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；12 h后，與ICH+生理鹽水鼠相比，ICH+原花青素組小鼠神經功能評分明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.2原花青素對ICH小鼠腦組織含水量的影響 與Sham+生理鹽水組[(75.65±0.74)%]比較，ICH+生理鹽水組小鼠[(83.16±1.09)%]腦含水量明顯升高(P<0.05)。而原花青素給藥治療后，與ICH+生理鹽水組比較，ICH+原花青素組小鼠[(80.38±0.98)%]腦組織含水量有明顯降低，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 ICH小鼠不同時間點神經功能評分

2.3原花青素對ICH小鼠腦組織細胞形態(tài)的改變 Sham+生理鹽水組的小鼠腦組織結構相較正常，形態(tài)正常，細胞著色均勻，排列整齊，沒有明顯出血癥狀。ICH+生理鹽水組小鼠神經細胞腫脹變形，出現自溶空泡現象，并且有大量紅細胞血塊聚集，血塊周圍組織松散，細胞核固縮。原花青素給藥后，ICH+原花青素組小鼠神經細胞變形發(fā)生空泡數量減少，紅細胞聚集明顯降低，組織結構趨近緊密，細胞核固縮現象減少,見圖1。

2.4原花青素對ICH小鼠腦組織細胞凋亡的作用 Sham+生理鹽水組和Sham+原花青素組小鼠海馬區(qū)腦組織偶見凋亡細胞，ICH+生理鹽水組小鼠海馬區(qū)腦組織見大量凋亡細胞表達，多見于高密度細胞層，染色質濃縮，核固縮。與ICH+生理鹽水組小鼠比較，ICH+原花青素組小鼠海馬區(qū)腦組織細胞凋亡密集度較低，核內染色質濃縮程度偏低，染色陽性的棕黃色顏色相對較淺，細胞凋亡數較少，見圖2。

2.5Western blot檢測 ICH發(fā)生后，小鼠腦細胞Bcl-2表達下調，Bax和Caspase-3表達上調，腦組織細胞發(fā)生明顯凋亡。原花青素給藥后，ICH小鼠腦細胞Bcl-2表達上調，Bax和Caspase-3表達下調；ICH小鼠腦組織GFAP和Iba-1表達上調，而原花青素給藥治療后，ICH小鼠腦組織GFAP和Iba-1表達下調，見圖3。

A：Sham+生理鹽水組；B：Sham+原花青素組；C：ICH+生理鹽水組；D：ICH+原花青素組

A：Sham+生理鹽水組；B：Sham+原花青素組；C：ICH+生理鹽水組；D：ICH+原花青素組

A：Western blot凝膠圖；B：細胞凋亡因子的表達水平；C：細胞GFAP和Iba-1的表達水平

3 討 論

小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的免疫細胞，激活的小膠質細胞針對受損的細胞發(fā)揮免疫調節(jié)、修復等作用[5]，但小膠質細胞過度激活后會對細胞產生毒性影響[6]。Iba1是小膠質細胞標志物。研究發(fā)現，ICH發(fā)生后血腫周圍的細胞破壞裂解后釋放大量的三磷酸腺苷(ATP)，誘導小膠質細胞分泌多種細胞因子，促進炎性反應的發(fā)生[7]。小膠質細胞在ICH后異?；钴S，并且可以檢測到小膠質細胞分泌的促炎癥因子，對血灶周圍的正常細胞產生神經毒性及炎性反應，誘導腦細胞的凋亡壞死[8]。本研究結果發(fā)生ICH后，腦組織小膠質細胞標志物Iba1表達明顯升高，與之前研究結果一致。

星形膠質細胞(astrocyte,Ast)是中樞神經內數量最多的神經膠質細胞，是中樞神經系統(tǒng)重要細胞。有研究發(fā)現星形膠質細胞是腦缺血時的主要受累細胞[9]。在受到創(chuàng)傷及腦損傷后星形膠質細胞活化適應損傷，表現為細胞數量增加，突起長度變化[10]。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)，是星形膠質細胞標志物，主要分布在活化的星形膠質細胞中[11]?；罨腁st產生大量的NO，導致神經細胞的凋亡壞死，介導細胞的炎性反應[12]。因此星形膠質細胞對ICH引發(fā)的腦水腫和繼發(fā)性腦損傷具有重要研究意義。這與本研究結果ICH發(fā)生后星形膠質細胞標志物GFAP表達明顯升高一致。

原花青素來自于傳統(tǒng)中藥-蓮、松樹皮等，是一種強效的抗氧化劑，是極具發(fā)展前景的天然植物提取物。近來有研究表明，原花青素有較強的清除自由基，抗腫瘤，預防動脈粥樣硬化、降脂、降壓，以及改善人體微循環(huán)等多重功效[13-16]。原花青素可以通過減輕腦水腫、抗炎、抗氧化及抑制缺血腦組織ASIC1a的表達，有效減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷[17]。與本研究結果原花青素可以緩解腦出血后神經功能損傷，降低腦出血后腦組織含水量和腦組織出血量，通過促進Bcl-2表達，抑制Bax和Caspase-3表達進而抑制腦組織神經細胞凋亡一致。

綜上，原花青素能緩解ICH后腦組織水腫癥狀，對ICH小鼠的腦損傷有一定的保護作用，其機制可能是因為原花青素能夠通過降低GFAP和Iba-1的表達，減少膠質細胞的活化數量，抑制神經毒性物質的產生，減輕腦水腫及細胞凋亡進而緩解繼發(fā)性腦損傷。

[1]XI G,HUA Y,KEEP R F,et al.Systemic complement depletion diminishes perihematomal brain edema in rats[J].Stroke,2001,32(1):162-167.

[2]程娟，柯開富．腦出血后繼發(fā)性腦損傷機制[J]．國際腦血管病雜志，2010，18(10)：787-791．

[3]高羽，董志．原花青素的藥理學研究現狀[J]．中國中藥雜志，2009，34(6)：651-655．

[4]BEDERSON J B,PITTS L H,TSUJI M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[5]TAYLOR R A,SANSING L H.Microglial responses after ischemic stroke and intracerebral hemorrhage[J].Clin Dev Immunol,2013:746068.

[6]梁瑞，吳鶴，戚基萍．活化的小膠質細胞在腦出血后的作用[J]．現代醫(yī)學，2015，43(2)：262-265．

[7]INOUE K.Microglial activation by purines and pyrimidines[J].Glia,2002,40(2):156-163.

[8]王新，李明軍，張坤，等．腦出血與小膠質細胞介導的炎癥相關性[J]．中國老年學雜志，2013，33(13)：3268-3270．

[9]PANICKAR K S,NORENBERG M D.Astrocytes in cerebral ischemic injury:morphological and general considerations[J].Glia,2005,50(4):287-298.

[10]BARKER A J,ULLIAN E M.Astrocytes and synaptic plasticity[J].Neuroscientist,2010,16(1):40-50.

[11]LOVE S,MCLEAN C.Overview and recent advances in neuropathology[J].Pathology,2011,43(2):87.

[12]NORDEN D M,FENN A M,DUGAN A,et al.TGFβ produced by IL-10 redirected astrocytes attenuates microglial activation[J].Glia,2014,62(6):881-895.

[13]凌智群，謝筆鈞．蓮房原花青素對氧自由基和脂質過氧化的作用[J]．營養(yǎng)學報，2002，24(2)：121-125．

[14]何佳聲，黃學鋒．原花青素對人結腸癌細胞SW620增殖和凋亡的影響[J]．中國中西醫(yī)結合外科雜志，2010，16(4)：439-442．

[15]馬亞兵，高海青，伊永亮，等．葡萄籽原花青素降低動脈粥樣硬化兔血清C反應蛋白水平[J]．中國動脈硬化雜志，2004，12(5)：549-552．

[16]薛燕濰，王峰．葡萄籽原花青素預防大鼠動脈粥樣硬化作用機制研究[J]．中國實用醫(yī)藥，2010，5(13)：44-45．

[17]陸景紅，任明山，李光武，等．葡萄籽原花青素對腦缺血再灌注損傷的保護作用[J]．中國臨床康復，2005，9(45)：99-101．