汪 波，周豫新，覃 桂，胡志剛，胡軍林＊＊

（1.湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院 武漢 430064；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065）

數(shù)千年來，中藥以其特有療效與作用，在防治疾病、保健康復(fù)方面顯示出獨特優(yōu)勢和魅力，是當(dāng)前國際醫(yī)藥市場重要組成部分[1]。伴隨自然醫(yī)療意識深入人心，中藥以其療效好、毒副作用小等特點，受到全世界消費者的關(guān)注[2]，據(jù)估算，65%-80%人口自主把健康治療基礎(chǔ)方式選擇在中醫(yī)藥上，中藥行業(yè)優(yōu)勢不斷突顯[3]，是國民經(jīng)濟(jì)重要支柱之一。

中藥材的質(zhì)量是中藥質(zhì)量的根本，也是保證中醫(yī)臨床用藥安全有效的關(guān)鍵。近年來，受資源緊缺、市場需求膨脹、從業(yè)人員質(zhì)量意識薄弱、監(jiān)管不到位等多種因素影響[4]，中藥材質(zhì)量堪憂，以假充真，誤用混用等現(xiàn)象屢禁不止，如以木防己、漢防己冒充防己，滇棗仁冒充酸棗仁，伊貝母充當(dāng)川貝母，據(jù)對全國四萬余批中藥材及飲片調(diào)查發(fā)現(xiàn)其合格率僅63.93%，逾50種中藥材摻偽率在50%以上，其中海風(fēng)藤摻偽率達(dá)95%，大青葉摻偽率達(dá)94%，川貝母摻偽率達(dá)68%，半夏摻偽率62%[5]，中藥材摻偽嚴(yán)重影響中藥質(zhì)量安全，調(diào)查發(fā)現(xiàn)近50%青蒿琥酯片為假藥[6]，60%的紅景天存在摻偽[7]，中藥材摻偽已然成為危害公眾健康的毒瘤，阻礙中藥材產(chǎn)業(yè)和中醫(yī)藥事業(yè)健康發(fā)展[8]。

作為神農(nóng)故里，時珍故鄉(xiāng)，湖北省中醫(yī)藥歷史悠久，資源豐富，道地藥材品目繁多，是我國重要的藥材主產(chǎn)區(qū)之一[9]，嚴(yán)格把控湖北省中藥材質(zhì)量對大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有不可忽視的促進(jìn)作用。然而，當(dāng)前藥典規(guī)定的中藥材性狀特征多依野生資源制定，大量流通的栽培品與野生品間的性狀差異給中藥材真?zhèn)舞b定造成很大障礙，且近源種的化學(xué)成分相似，以其為標(biāo)記物的鑒別手段力所不及[10]，給中藥材質(zhì)量監(jiān)管提出一定挑戰(zhàn)。

DNA條形碼是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對較短的DNA片段實現(xiàn)物種鑒定的分子診斷新技術(shù)[11]，通過比較物種中的標(biāo)準(zhǔn)鑒定片段，對物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確識別和鑒定。陳士林等通過分析753屬4 800種6 600余份藥用植物樣本，提出以ITS2為主，葉綠體psbA-trnH為輔的植物類中藥材鑒定體系[12]，并建立了信息量最為豐富的藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫，涵蓋23,262種藥用植物的78,847條序列（http://www.tcmbarcode.cn/china/）[13]，該鑒定體系已被中國藥典2015年版收錄。本研究旨在利用DNA條形碼鑒定技術(shù)對湖北省市場流通中藥材進(jìn)行調(diào)查分析，探討湖北省中藥材摻偽情況，為中藥材質(zhì)量監(jiān)管提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料均為湖北市場流通中藥材抽樣，根及根莖類藥材365份，皮類及莖木類藥材35份，葉類及全草類藥材3份，果實及種子類藥材79份，動物類藥材12份，其它類藥材（如海金沙、蒲黃等）12份，共計中藥材樣品506份，隸屬59個物種，涵蓋動物、植物及真菌，涉及中藥材相關(guān)企業(yè)及醫(yī)療機(jī)構(gòu)89家。中藥材DNA條形碼識別系統(tǒng)由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所陳士林教授提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

對所收集的植物藥材用75%乙醇擦拭表面后，刮掉外表面，取干燥組織約30 mg，用高通量組織研磨儀（Scientz-48，China）研磨120 s（50 Hz）至呈粉末狀，使用植物DNA提取試劑盒（TIANGEN Biotech(Beijing)Co.,Ltd DP305-02）提取總DNA，稍作改進(jìn)如：56℃水浴過夜，使用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提2次，加入-20℃預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA。動物藥材用75%乙醇清潔表面后，取組織約30 mg，剪碎后使用核分離緩沖液（200 mM Tris-HCl，50 mM EDTA，250 mM NaCl，2%PVP-40，pH 8.0）洗滌樣品兩次，按照動物基因組DNA快速抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，SK8222）標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序等參考中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則（《中華人民共和國藥典》2015年版通則9107），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，對條帶單一且清晰的PCR產(chǎn)物純化后使用ABI3730XL（Applied Biosystems Co.,USA）測序儀進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

將測序所得峰圖使用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.,USA）校對拼接，去除引物區(qū)及低質(zhì)量區(qū)，從而獲得植物類中藥材ITS2鑒定序列及動物類中藥材COI鑒定序列，采用MEGA6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）對所獲序列進(jìn)行比對分析。據(jù)中藥材DNA條形碼識別系統(tǒng)操作流程，與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，比對算法采用Blast1，E值（E-value）設(shè)為1e-5[14]，確定樣品拉丁名后，與2015年版中國藥典規(guī)定的基原物種比對判別藥材真?zhèn)巍?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增成功率

從收集的506份樣品中，成功獲得動物類藥材鑒定序列COI 12條，植物類藥材鑒定序列ITS2 482條，共計494份樣品獲得高質(zhì)量鑒定序列，總體來看，PCR擴(kuò)增成功率占總抽樣的98%。果實及種子類藥材、皮類及莖木類藥材、葉類及全草類藥材和動物類藥材的擴(kuò)增成功率均為100%；根及根莖類擴(kuò)增成功率次之為98%，紅參、天麻等品種未得到有效擴(kuò)增；其它類藥材擴(kuò)增成功率75%，如乳香、沒藥等品種未能檢測到擴(kuò)增條帶（圖1）。

圖1 抽取樣品DNA條形碼鑒定統(tǒng)計分析結(jié)果

2.2 鑒定成功率

在獲得的494條序列中，經(jīng)比對可確定物種的序列477條，鑒定成功率為97%。如圖1所示果實及種子類藥材、葉類及全草類藥材和動物類藥材均能準(zhǔn)確鑒定到種，約1%（4/365）的根及根莖類藥材（粉葛）、37%（13/35）的皮類及莖木類藥材（黃柏）僅能鑒定到屬。

2.3 中藥材摻偽情況分析

經(jīng)過與DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定出偽品28份，占所抽查樣品的5.5%。根及根莖類藥材偽品比例為6%，其中川貝母摻偽率20%，法半夏17%，黃芩5%；果實及種子類藥材摻偽率6.3%，青葙子及桃仁分別存在50%和44%的摻偽；皂角刺摻偽率9%，占皮類及莖木類藥材的2.9%（圖2）；葉類及全草類和動物類藥材經(jīng)鑒定均為正品。

圖2 中藥材偽品鑒定結(jié)果統(tǒng)計圖

據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定川貝母基原川貝母（Fritillaria cirrhosa）、暗紫貝母（F.unibracteata）、甘肅貝母（F.przewalskii）、梭砂貝母（F.delavayi）、太白貝母（F.taipaiensis）或瓦布貝母（F.wabuensis），法半夏基原半夏（Pinellia ternata），黃芩基原黃芩（Scutellaria baicalensis），青葙子基原青葙（Celosia argentea），桃仁基原桃（Prunus persica）或山桃（P.davidiana），皂角刺基原皂莢（Gleditsiasinensis）。

3 討論

3.1 DNA條形碼鑒定技術(shù)在中藥材質(zhì)量控制中的優(yōu)勢

DNA條形碼鑒定法較傳統(tǒng)鑒定方法，技術(shù)簡便，易于操作；鑒定準(zhǔn)確，具有獨一無二的可重復(fù)性；使用方便，采用標(biāo)準(zhǔn)操作流程可批量完成鑒定工作[15]。本研究按照《中華人民共和國藥典》2015年版提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，在兩周時間內(nèi)完成了506份中藥材鑒定工作，成功獲得494份樣品的DNA條形碼序列，準(zhǔn)確鑒定477份樣品，鑒定成功率達(dá)97%。針對多基原藥材及種子類藥材的鑒定更是展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，如川貝母基原為六種同屬植物，各基原物種間及栽培品與野生品間的性狀差異較小，使得形態(tài)鑒定困難，摻偽嚴(yán)重，本研究中有20%的川貝母樣品經(jīng)DNA條形碼鑒定為伊貝母；種子類藥材形狀小，性狀特征相似，真?zhèn)胃请y辨，經(jīng)DNA序列比對，發(fā)現(xiàn)44%的桃仁樣品為苦杏仁，青葙子實為綠穗莧種子（圖2）。DNA條形碼鑒定技術(shù)在對中藥材質(zhì)量控制方面具有顯著的優(yōu)越性。

3.2 PCR擴(kuò)增失敗原因分析

3.2.1 中藥炮制品

中藥材在加工處理過程中，常會采用繁瑣炮制手段[16]，如紅參炮制工藝蒸制3h，70℃烘10 h；天麻105℃蒸制20min，切薄片，(70±2)℃干燥4 h。經(jīng)長時間高溫處理會導(dǎo)致DNA嚴(yán)重降解影響PCR擴(kuò)增效率，在本研究中收集了紅參樣品1份，天麻7份，均擴(kuò)增失敗，此類樣品的鑒定方法仍有待優(yōu)化，如采用磁珠法[17]等提高DNA提取效率，或采用小片段DNA條形碼序列[18]等提高PCR擴(kuò)增效率。

3.2.2 樹脂類藥材

樹脂類藥材源自植物分泌物或滲出物，如源自松科的松香，棕櫚科的血竭，橄欖科的乳香和沒藥都是常見的樹脂類藥材，這類藥材DNA含量極低，降解也是極為嚴(yán)重，本研究收集的樹脂類藥材也均擴(kuò)增失敗，樹脂類藥材分子鑒定仍是DNA條形碼鑒定難點。作者曾以長度100 bp的trnL內(nèi)含子P6環(huán)序列為DNA條形碼成功鑒定了樹脂類藥材血竭及其混偽品龍血竭[19]，小片段DNA序列在樹脂類藥材鑒定中極具潛力，但由于片段過小，變異位點有限，仍需擴(kuò)大樣本評估鑒定效率。

3.3 物種鑒定失敗原因分析

盡管以ITS2為主psbA-trnH為輔的DNA條形碼體系對絕大部分中藥材具有很好的鑒定效率，但由于其片段長度限制，對部分近源種的鑒定仍有局限性，如黃柏與關(guān)黃柏，分別為黃皮樹（Phellodendronchinense）和黃檗（P.amurense）的干燥樹皮，與本研究結(jié)果一樣，現(xiàn)有條形碼序列并不能對其進(jìn)行區(qū)分[20]。葛根和粉葛分別來源于野葛（Pueraria lobata）和甘葛藤（P.thomsonii），現(xiàn)版藥典將其分列為兩個品種，但據(jù)中國植物志記載甘葛藤為野葛變種，屬種下關(guān)系，而中藥材DNA條形碼鑒定體系僅針對種水平的鑒定，葛根和粉葛的DNA序列相似度極高。對于現(xiàn)有DNA條形碼鑒定能力較差的物種，將考慮重新篩選適宜鑒定序列[21]或采用單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測[22]。

4 展望

DNA作為遺傳信息載體，具極高遺傳穩(wěn)定性，不受發(fā)育階段、外部環(huán)境、組織差異影響，鑒定結(jié)果具高度重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于中藥材標(biāo)準(zhǔn)化真?zhèn)舞b定[23]，是中藥材監(jiān)管有效手段。不斷完善近源種及特殊炮制藥材DNA條形碼鑒定方法，針對摻偽嚴(yán)重品種建立快速檢測體系，與其它中藥檢測技術(shù)手段不斷融合，必將對中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化起到巨大推動作用。

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