李順意，于秋香，向臘，周玉玲，張桂敏

湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源綠色轉(zhuǎn)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430062

玉米赤霉烯酮 (Zearalenone，ZEN)是一種主要由鐮刀菌屬Fusarium真菌產(chǎn)生的非甾體雌激素類真菌毒素，廣泛存在于玉米、大麥、小麥和高粱等谷物及其副產(chǎn)品中。ZEN通過污染的谷物農(nóng)副產(chǎn)品及飼料進入食物鏈，被動物吸收后，引起牲畜雌激素綜合癥狀，導(dǎo)致牲畜體內(nèi)雌激素過多，引起不孕不育、流產(chǎn)和死胎現(xiàn)象，并有很強的致癌性，嚴(yán)重危害牲畜及人類健康。有多篇文獻對ZEN的合成、代謝、毒性、脫毒及控制等進行了綜述[1-4]。研究ZEN的脫毒方法和技術(shù)是應(yīng)對ZEN危害的主要措施。目前ZEN脫毒主要方法有物理法、化學(xué)法和生物法。物理法脫毒效率不高，而且破壞谷物營養(yǎng)成分，影響食品口感；化學(xué)法可以有效脫毒，但是如何從谷物食品中去掉脫毒用的化學(xué)成分很困難，容易造成二次污染。因此利用生物技術(shù)對ZEN及其衍生物進行降解和脫毒是未來解決這一問題的主要方法。生物技術(shù)脫毒主要是通過活菌降解和酶法降解兩種途徑。本文簡要介紹了ZEN及衍生物的結(jié)構(gòu)和降解ZEN的微生物種類、降解特性，然后詳細(xì)介紹目前研究的ZEN降解酶的種類、蛋白結(jié)構(gòu)及其異源表達和應(yīng)用的情況。

1 ZEN及其衍生物

ZEN首次由Stob等[5]于1962年從玉米中分離得到，1966年由Urry等[6]測定了化學(xué)結(jié)構(gòu)，是一種酚的二羥基苯酸內(nèi)脂結(jié)構(gòu)化合物，分子式為C18H23O，平均分子量為318 Da，白色晶體，微溶于水，沸點為510.12℃，熔點為217.32℃。ZEN可以經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)變?yōu)棣?玉米赤霉烯醇 (α-zearalenol，α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇 (β-zearalenol，β-ZOL)、玉米赤霉酮 (Zearalanone，ZAN)、α-玉米赤霉醇(α-zearalanol，a-ZAL) 和β-玉米赤霉醇 (β-zearalanol，β-ZAL)等幾種衍生物 (表1)。ZEN及其衍生物與動物內(nèi)源性雌激素β-雌二醇有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，故可以與動物細(xì)胞內(nèi)β-雌二醇的受體結(jié)合而表現(xiàn)出毒性。研究表明，ZEN及其衍生物與鼠子宮胞漿的β-雌二醇受體的親和力依次是α-ZAL﹥α-ZOL﹥β-ZAL﹥ZEN﹥β-ZOL[7]，與雌激素受體的親和力越強，則雌激素活性就越大，毒性也就越大。

ZEN通過霉變的玉米、小麥、高粱等食品和飼料被動物吸收，主要表現(xiàn)為亞急性和慢性毒性，急性毒性相對較低，小鼠口服LD50﹥20000 mg/kg體重，大鼠口服LD50>10000 mg/kg體重[8]。多國設(shè)定了食物和飼料中ZEN的最高限值。中國國家標(biāo)準(zhǔn) (GB 13078.2-2006)設(shè)定了飼料中ZEN的最大限量為500 μg/kg[9]，而實際上我國谷物及其制品普遍存在高濃度的ZEN污染情況[10-12]。生物降解可以將ZEN高效轉(zhuǎn)化為低毒或無毒的產(chǎn)物，環(huán)保安全，不會破壞谷物的營養(yǎng)物質(zhì)，因此開發(fā)ZEN的脫毒技術(shù)具有重大意義。

表1 玉米赤霉烯酮及其衍生物的結(jié)構(gòu)Table 1 The structure of zearalenone and its derivatives

2 活菌降解

ZEN生物降解主要包括活菌降解法和酶降解法?；罹到夥ㄊ抢梦⑸飳EN的轉(zhuǎn)化從而降低其對動物的毒性。為了能降解ZEN，自20世紀(jì)80年代開始國內(nèi)外的微生物學(xué)家就開始分離各種能降解ZEN的微生物，表2為部分已經(jīng)分離到的可以降解ZEN及其衍生物的真菌和細(xì)菌及其降解性質(zhì)?；罹摱敬嬖诰昱囵B(yǎng)時間長、降解活性低和后期菌株本身難以去除等問題，甚至有些菌株還是致病菌。因此近幾年來，利用益生菌進行ZEN的降解研究越來越多，其中主要有酵母菌、芽孢桿菌和乳酸菌。

多種酵母菌具有降解ZEN的能力[13]。2004年Molnar等[14]篩選并通過18S rDNA鑒定了能降解ZEN的解毒毛孢酵母Trichosporon mycotoxinivoran，代謝產(chǎn)物中沒有檢測到α-ZOL或β-ZOL。該菌株也可以降解赭曲霉素A(Ochratoxin A)等其他真菌毒素，可以用于動物飼料的脫毒處理。2010年Vekiru等[15]繼續(xù)對該酵母降解ZEN的機理進行了研究。他們用LC-MS/MS、LC-DAD和NMR等方法分離并鑒定了ZEN及其代謝產(chǎn)物。結(jié)果證明ZEN的內(nèi)酯環(huán)被水解，體外試驗顯示產(chǎn)物不能與雌激素受體蛋白結(jié)合，所以沒有毒性。吳暉等[16]報道了產(chǎn)朊假絲酵母菌株CLY01在添加ZEN的培養(yǎng)基中發(fā)酵，96 h后ZEN的去除率達96.79%，ZEN的濃度由起始的3.893 mg/L降為0.125 mg/L，該課題組還對ZEN降解酶進行過系列研究。Zhang等[17-18]報道釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae(1×108CFU/mL)48 h能將發(fā)酵液中濃度為2.75 μg/mL的ZEN完全降解。芽孢桿菌是研究最多的能降解ZEN的益生菌。Lei等[19]從動物食道、發(fā)霉的食物和飼料及土壤等來源篩選得到36個菌株，其中有5個菌株能降解液體培養(yǎng)基中50%的ZEN，最強的一株對ZEN的降解率達到88.65%，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisANSB01G。2016年張倩等[20]從135份赤霉病高發(fā)區(qū)土壤樣品中篩選到一株解淀粉芽孢桿菌Fu2-3，表現(xiàn)出明顯的ZEN降解效果，6 h內(nèi)對ZEN的清除率達95%以上。乳桿菌能通過兩種方式對ZEN脫毒。一是通過物理作用吸附ZEN，細(xì)胞實驗表明，其吸附的濃度在0.79–62.82 μmol/L[21-22]。乳桿菌Lactobacillus plantarum應(yīng)用到玉米飼料上，能降低玉米中ZEN的濃度，發(fā)酵4 d后，玉米中ZEN能降低68%–75%[23]。二是通過酶降解作用。Zhao等[24]報道從27種傳統(tǒng)發(fā)酵食物中篩選到3株能降解ZEN的乳桿菌，48 h對溶液中的ZEN清除率約為45%。表2所示為可以降解ZEN及其衍生物的真菌和細(xì)菌，其中有12種是《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760-2014)目錄中的益生菌[25]，其他具有降解活性的菌株以后也可能加入到益生菌目錄中。從表2可以看出芽孢桿菌是報道最多、對ZEN有較好降解效果的益生菌，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等益生菌更是廣泛用于畜牧水產(chǎn)飼料添加劑，如果能增強其降解ZEN的功能，將具有重要應(yīng)用價值。

原始菌株具有不同的ZEN降解能力，但是因為菌株培養(yǎng)時間長、降解活性低等問題，在實際脫毒中應(yīng)用尚需要對菌種進行選育。因此研究ZEN降解酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)及降解的機制，具有重要的意義，開發(fā)ZEN降解酶是未來ZEN降解的發(fā)展趨勢。

表2 主要ZEN降解菌Table 2 Main strains with capability of ZEN degradation

3 ZEN降解酶的發(fā)現(xiàn)

上述能對ZEN脫毒的微生物主要方式是微生物能產(chǎn)生酶水解或氧化ZEN，從而破壞其結(jié)構(gòu)并轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的小分子代謝物。有多種ZEN脫毒關(guān)鍵酶的研究和報道[45]。2002年Takahashi-Ando等[46]發(fā)現(xiàn)粉紅粘帚霉Clonostachys roseaIFO 7063能將ZEN降解為低毒性的產(chǎn)物，他們從含ZEN的培養(yǎng)基培養(yǎng)的C.roseaIFO 7063中提取了一種堿性水解酶ZHD101，測定了部分氨基酸殘基序列，根據(jù)氨基酸序列設(shè)計引物克隆了該酶的基因zhd101，并在裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe和大腸桿菌Escherichia coli中得到表達，表達的產(chǎn)物具有酶活性，能水解ZEN。這是首次鑒定并克隆ZHD101酶基因的報道，對后續(xù)ZEN的生物法降解具有重要指導(dǎo)意義。2005年Utermark等[47]通過基因zhd101突變的方法證實ZHD101能降解ZEN。

除了ZHD101，ZEN降解酶的報道并不多，利用ZEN作為關(guān)鍵詞搜索UniProt和PDB數(shù)據(jù)庫，選擇UniProt數(shù)據(jù)庫及文獻報道的19種酶進行了分析，圖1為根據(jù)這些酶的序列比對構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹。其中第一分支為同源性最高的，有13種ZEN降解酶，分別為來源于C.rosea的Q8NKB0[46](PDB ID 2WZL)、A0A023IYG7[47]、A0A023IYG2[48]、A0A023IYH9[48]、W0LXP2[27]和AN 154[27]，鏈孢粘帚菌Clonostachys catenulatumAN 169的AN 169[27]，淡色生赤殼菌Bionectria ochroleuca的 A0A0N9XBU7(Uniprot)、C9EIK3(Uniprot)、G9C2T3(Uniprot) 和 W0M193[27]，侵占木霉Trichoderma aggressivum的W0M1M6[27]和AN 171[27]。這一組ZEN降解酶由264個氨基酸殘基組成，分子量約為28 kDa，氨基酸序列同源性大于95.8%，其中W0LXP2和AN 169、W0M1M6和AN 154具有一致的序列，屬于ZHD101的高度同源蛋白。

進化樹分支另一端不動桿菌Acinetobactersp.SM04的G8EUU4是另外一種ZEN降解酶。2011年Yu等[34]篩選到該菌可以對ZEN脫毒，2012年，Yu等[49]又鑒定出其對ZEN有脫毒功能的是過氧化物酶 (Peroxiredoxin，EC 1.11.1.15)，他們克隆了過氧化物酶基因并在大腸桿菌中成功表達。毒性試驗表明，過氧化物酶在過氧化氫存在的條件下具有ZEN脫毒效果，但是過氧化氫的存在可能會影響該酶在食品和飼料中的應(yīng)用。

圖1 ZEN降解酶的系統(tǒng)發(fā)育樹(酶的代號為UniProt或PDB數(shù)據(jù)庫中的ID)Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of ZEN degradation enzyme.The enzyme codes are the ID in Uniprot or PDB databases.

其他來源的ZEN降解酶有稻瘟病菌Magnaporthe grisea的 A4UUQ1(Uniprot)、楊樹黑斑病菌Marssonina brunneaf.sp.multigermtubi(strain MB_m1)的 K1WVX0[50]、粗糙脈孢菌Neurosporacrassa(strain ATCC 24698/74-OR23-1A/CBS 708.71/DSM 1257/FGSC 987)的Q1K8M1[51]、巴西孢子絲菌Sporothrix brasiliensis5110的A0A0C2IUP2、申克孢子絲菌Sporothrix schenckii1099-18的A0A0F2LS72[52]。這些酶彼此差別較大，與ZHD101相比也有較大的差別，同源性在11%–32%之間，其中與ZHD101同源性最高的是M.brunneai的 K1WVX0[50]，同源性為32%。以上5種酶是通過對基因組進行基因功能注釋得到的疑似ZEN降解酶，并沒有對具體的基因進行過克隆表達和功能研究。這些微生物的ZEN降解酶有待深入研究，以探索是否可以發(fā)現(xiàn)更有效的ZEN降解酶。

4 酶蛋白的結(jié)構(gòu)及催化作用分子機理

4.1 ZEN降解酶的結(jié)構(gòu)模擬及分類

2014年P(guān)opiel等[27]分析了ZHD101及同源性很高的C.catenulatumAN 169、C.roseaAN 154和T.aggressivumAN 171的ZHD酶氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它們與α/β水解酶折疊家族的3-氧代己二酸烯酸內(nèi)酯酶 (PDB ID 2XUA)和過氧化物α/β水解酶Lpx1(PDB ID 2Y6U)的氨基酸序列有較大的同源性，于是以2XUA和2Y6U為模板模擬了3種ZHD酶的構(gòu)象，結(jié)果顯示它們都具有α/β水解酶折疊家族 (ab-hydrolase)的空間構(gòu)象特征。α/β水解酶折疊家族是一種廣泛存在的結(jié)構(gòu)類型，一般由5個以上的β-折疊組成的內(nèi)核結(jié)構(gòu)域和覆蓋內(nèi)核上的α-螺旋組成的帽子結(jié)構(gòu)域組成，并有一個由親核氨基酸、組氨酸和另外一個氨基酸組成催化三聯(lián)體[53]。ZHD屬于Abhydrolase_6，目前該家族共有3819個基因，有53個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的報道(http://bioweb.ensam.inra.fr/esther)[54]。

4.2 ZEN降解酶的晶體結(jié)構(gòu)

ZEN降解酶的晶體結(jié)構(gòu)解析首先由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所的郭瑞庭團隊[55]完成。郭等用X-射線衍射的方法首次測定了來源于C.rosea的ZEN水解酶ZHD(PDB ID 3WZL)和ZHD-ZEN復(fù)合物 (PDB ID 3WZM)的晶體結(jié)構(gòu)，圖2為PyMOL顯示的ZHD與底物ZEN復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)圖。在此基礎(chǔ)上，他們又測定了ZHD的單突變 (S102A)和雙突變體 (S102A/V153H)及其與ZEN的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)[56]。結(jié)構(gòu)分析顯示該酶具有以下特點。1)酶蛋白由兩個結(jié)構(gòu)域組成：一個是α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)域，由8段β-折疊組成的內(nèi)核和兩側(cè)包圍的7段α-螺旋組成；另一個是覆蓋于其上的帽子結(jié)構(gòu)域，由4段α-螺旋組成，圖3為ZEN降解酶與α/β水解酶折疊蛋白的空間結(jié)構(gòu)模塊示意圖。這個結(jié)果與上述2014年P(guān)opeil等[27]模擬的構(gòu)象相似，表明模擬的結(jié)果是正確的。2)酶與底物結(jié)合的位點位于兩個結(jié)構(gòu)域之間的空穴，底物ZEN通過3個氫鍵和幾個非極性鍵嵌合到這個空穴中。Trp183是ZEN和酶結(jié)合的重要位點，當(dāng)Trp183突變?yōu)锳la、His或Phe時，酶活性喪失。Leu33、Val153、Met154、Val158、Leu135、Phe221、Pro128、Ile191和Pro192等氨基酸的側(cè)鏈也與底物直接接觸，是酶與底物結(jié)合的保守位點。3)酶的活性中心為Ser102-His242-Glu126組成的催化三聯(lián)體 (圖2)，Ser102羥基的O原子作為親核基團攻擊底物ZEN內(nèi)酯環(huán)上的羰基C原子，從而引發(fā)水解反應(yīng)。郭的團隊還對該酶進行了一系列的氨基酸定點突變研究，突變體V153H蛋白對α-ZOL水解的比活力增加了3.7倍，Km增加了2.7倍，但kcat/Km增加了5.2倍，結(jié)構(gòu)分析顯示可能是因為V153H突變使得催化三聯(lián)體中的H242獲得了更大的空間。這些結(jié)構(gòu)和系列突變酶的研究揭示了酶的催化反應(yīng)機理，為提高ZHD的催化能力和推進ZHD的應(yīng)用提供了重要的理論基礎(chǔ)。

圖2 PyMOL顯示的ZHD與底物ZEN復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID 3WZM)Fig.2 Structure of ZHD and ZEN complex(PDB ID 3WZM)using program PyMOL.

圖3 ZHD及α/β水解酶折疊家族的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Toplogy diagrams of ZHD and α/β-hydrolase fold enzymes.

5 ZEN降解酶的異源表達

由于天然ZEN降解酶的產(chǎn)量及活性較低，對這些酶的異源高效表達成了ZEN高效降解的希望。我們對ZEN降解酶的種類來源及異源表達的研究匯總見表3。異源表達研究最多的是C.rosea的zhd101基因，目前該基因已經(jīng)在大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母和水稻中得到表達。2002年Takahashi-Ando等[47]在E.coli中成功表達了zhd101基因，但在S.pombe中卻沒有表達。2004年，Takahashi-Ando等[57]為了更直觀地檢測ZHD101解毒活性，在E.coli和S.cerevisiae中表達了ZHD101和綠色熒光蛋白的融合蛋白，重組大腸桿菌表現(xiàn)出較強的ZEN降解酶活性，但重組釀酒酵母ZEN降解酶活性則較弱，培養(yǎng)基中添加2 μg/mLZEN或ZOL，重組大腸桿菌1 h能將其完全降解，而重組釀酒酵母4 d只能降解其中的75%。隨后Takahashi-Ando[58]對zhd101基因進行了密碼子優(yōu)化，研究轉(zhuǎn)基因釀酒酵母對ZEN的降解能力，結(jié)果表明該基因的表達水平增加了約20倍，28℃48 h或37℃8 h就能完全降解培養(yǎng)基中2 μg/mL的ZEN，且降解產(chǎn)物中沒有檢測到β-ZOL。2005年，Higa-Nishiyama等[59]將zhd101基因與增強的綠色熒光蛋白基因融合，融合基因在水稻葉片中成功表達，能有效降解ZEN毒素，且在種子內(nèi)也檢測到ZEN降解活性。國內(nèi)的程波財?shù)萚60]從粉紅螺旋聚孢霉中克隆到ZEN-jjm基因并在E.coli和畢赤酵母GS115中得到異源表達，大腸桿菌破菌上清液在3 h內(nèi)能完全降解濃度為 1 μg/mL的ZEN等[60]，畢赤酵母發(fā)酵上清液需要9 h才能降解濃度為1 μg/mL的ZEN[61]。劉海燕等[62]從粉紅粘帚霉菌中克隆到zlhy-6基因，并在P.pastorisGS115中得到表達，發(fā)酵上清4 h能降解濃度為1.6 μg/mL的ZEN。與zhd101基因相比對，ZEN-jjm基因和zlhy-6基因的同源性高達98%。2015年，王義春等[63]用多拷貝技術(shù)構(gòu)建了zlhy-6基因表達工程菌并在巴斯德畢赤酵母中實現(xiàn)分泌表達，發(fā)酵液中的酶活力達到10 U/mL，1 h內(nèi)對濃度為20 μg/mL的ZEN降解率達99%以上。

表3 主要ZEN降解酶來源、異源表達及特征Table 3 The origin,heterologous expression and properties of main ZEN hydrolases

為了進一步探索ZHD101的應(yīng)用，我們對zhd101基因 (GenBank No.AB076037.1)進行了密碼子優(yōu)化 (優(yōu)化的基因GenBank No.KX229746)并首次在畢赤酵母中實現(xiàn)了高效表達[61]。結(jié)果表明含有3拷貝的轉(zhuǎn)化子酶蛋白分泌量最高，表達上清可以有效降解ZEN及其衍生物α-ZOL和β-ZOL，10 μg/mL的ZEN經(jīng)過15 min就降解到3.66 μg/mL，30 min內(nèi)被完全降解。5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后的酶活力達到150.1 U/mL，是搖瓶發(fā)酵酶活力的6.7倍。在釀酒酵母發(fā)酵前用ZHD酶處理麥芽汁底物，結(jié)果表明，90%的ZEN在ZHD101酶加入后12 min內(nèi)就被降解了，該研究為ZHD酶的應(yīng)用提供了一種新的途徑。

6 ZEN生物降解的展望

盡管已經(jīng)有多篇文章對ZEN生物降解進行了研究，取得了一定的成果，但離實際應(yīng)用還存在一定的距離。為了實現(xiàn)對ZEN的高效生物脫毒，我們認(rèn)為需要從以下幾方面深入研究。1)ZEN脫毒酶基因資源的深度挖掘。目前真正報道有ZEN降解活性的酶就只有ZHD101及其同源性95%以上的同源物，因此克隆新的ZEN降解酶基因是未來的一個發(fā)展方向。2)酶的蛋白質(zhì)工程。蛋白質(zhì)工程是提高酶活性改善酶性能的重要手段，目前ZHD101的結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，相信已經(jīng)有很多課題組在基于結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上在對該酶進行改造，提高酶比活力和穩(wěn)定性。3)酶的高效表達和制備技術(shù)。目前ZEN降解酶通過異源表達系統(tǒng)表達的最高酶活報道是150.1 U/mL，但是蛋白的表達量很低，還有很大的提升空間，可以利用基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)進一步提高酶的產(chǎn)量，降低應(yīng)用成本。如能得到更高效降解ZEN的菌株或酶，為ZEN的生物降解提供可行的技術(shù)和工藝，將對飼料安全和食品安全具有重要意義。

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