李歡歡，黃承浩

廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361102

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人類基因組計劃初步完成，人們對基因的功能也有了一定的認(rèn)識，但是仍然有更多的問題亟待探索，例如基因與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，基因與腫瘤耐藥性的關(guān)系等。如何利用人類基因組以及已有的技術(shù)手段研究疾病發(fā)生發(fā)展過程，尋找與疾病和健康相關(guān)的功能性基因，從而建立新的疾病診斷預(yù)防和治療方法，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)及開發(fā)新的藥物，是科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)。高通量功能性基因篩選以基因編輯技術(shù)為基礎(chǔ)，通過在全基因組范圍內(nèi)干擾基因功能來篩選目的表型，是剖析基因功能、探索生物進(jìn)程和疾病的重要工具。近年來，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展和成熟，功能性基因篩選也隨之變得更加簡便高效，在生命科學(xué)的研究中發(fā)揮了重要作用。本文主要介紹應(yīng)用CRISPR-Cas9文庫進(jìn)行功能性基因篩選的方法及目前的研究進(jìn)展。

篩選功能性基因的常用策略主要分為功能獲得型 (Gain-of-function)篩選和功能缺失型 (Lossof-function)篩選。功能獲得型篩選策略通常利用cDNA文庫使基因過表達(dá)來篩選功能性基因[1]。由于細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組非常復(fù)雜，難以構(gòu)建覆蓋整個細(xì)胞基因組的cDNA文庫，導(dǎo)致cDNA文庫的庫容量有限；此外，cDNA的表達(dá)并不受細(xì)胞內(nèi)在調(diào)控，因此經(jīng)常會出現(xiàn)基因異常高表達(dá)，影響對結(jié)果的判斷，這些都限制了cDNA文庫在功能性基因篩選中的應(yīng)用。功能缺失型 (Loss-of-function)篩選策略是通過抑制基因表達(dá)或基因敲除來篩選功能性基因。RNAi是真核生物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的生物進(jìn)程，通過siRNA介導(dǎo)其同源RNA降解實(shí)現(xiàn)抑制靶基因表達(dá)的作用[2]，因而曾被廣泛應(yīng)用于高通量的功能缺失型基因篩選[3]。與cDNA文庫相比，RNAi文庫篩選具有高通量、簡便、經(jīng)濟(jì)、高效的優(yōu)點(diǎn)，但是其仍然存在難以忽視的問題。RNAi技術(shù)是降低基因表達(dá)水平來影響表型，并不能完全抑制基因表達(dá)，因此其造成的表型變化不夠穩(wěn)定明顯，影響對基因功能的判定[4]。此外，細(xì)胞內(nèi)源性的RNAi途徑導(dǎo)致RNAi篩選存在著廣泛的脫靶效應(yīng)[5]，成為影響RNAi文庫篩選的另一個重要問題。近年來CRISPR-Cas9技術(shù)大放異彩，可以用于酵母菌[6]、哺乳動物細(xì)胞[7]、斑馬魚[8]、水稻[9]、小鼠[10]等各類細(xì)胞及生物體的基因編輯，科學(xué)家們也開始利用CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行功能性基因的篩選。CRISPR-Cas9技術(shù)既可通過誘導(dǎo)基因突變進(jìn)行功能缺失型 (Loss-offunction)篩選，又可通過激活轉(zhuǎn)錄進(jìn)行功能獲得型 (Gain-of-function)篩選，不僅可以作用于基因的編碼區(qū)，還可以靶向基因非編碼區(qū)[11]，與RNAi技術(shù)相比具有相對較低的脫靶效率和更廣泛的作用位點(diǎn)，因而逐漸成為功能性基因篩選的熱點(diǎn)方法。

1 CRISPR-Cas9：精準(zhǔn)的基因編輯技術(shù)

CRISPR-Cas是廣泛存在于細(xì)菌和古菌中的獲得性免疫系統(tǒng)，能夠剪切外源基因，抵御病毒對細(xì)菌的入侵[12]，最早由Ishino等發(fā)現(xiàn)于1987年[13]，直到2010年CRISPR的機(jī)制和功能才被研究清楚[14-16]。目前被發(fā)現(xiàn)的CRISPR系統(tǒng)有3種類型，均由3種元件組成：一簇CRISPR相關(guān)基因 (Cas)、非編碼RNA以及一列重復(fù)序列[17]。Cas基因可以和核酸酶、解旋酶、聚合酶結(jié)合，是CRISPR-Cas系統(tǒng)中執(zhí)行剪切功能的元件[18]。一系列短重復(fù)序列被來源于外源基因的間隔序列 (Protospacer)隔開，共同構(gòu)成了CRISPR RNA(crRNA)陣列。通常間隔序列與前間區(qū)序列鄰近基序 (PAM)相連[19]。不同物種PAM序列不同，例如目前在哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用廣泛的spCas9識別5′-NGG PAM序列，而在細(xì)胞基因組中平均8–12 bp就有這樣的序列出現(xiàn)[20-21]?；蚪M中廣泛存在的PAM序列為CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于全基因組提供了可能?；蜃嫌问且欢螏装賐p的非編碼基因，被命名為前導(dǎo)序列[18]。CRISPR-Cas系統(tǒng)中最常用于基因編輯的是Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)，由Cas9核酸酶、crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)三部分組成[22]。執(zhí)行基因剪切功能時，首先是crRNA轉(zhuǎn)錄為pre-crRNA，同時與crRNA互補(bǔ)的tracrRNA也進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并激活Cas9及特異性的RNA核酸酶對pre-crRNA進(jìn)行加工，成熟的crRNA與tracrRNA及Cas9核酸酶形成復(fù)合體，進(jìn)而在向?qū)NA的指導(dǎo)下靶向特定位點(diǎn)進(jìn)行切割[23]。研究者們將密碼子優(yōu)化的Cas9和必要的RNA元件在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行異源重組表達(dá)[24]，并將crRNA和tracrRNA融合表達(dá)形成一條嵌合單鏈向?qū)NA(sgRNA)[25]，精簡了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，極大地提高了CRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于基因編輯的可行性，使其更加便捷高效。在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，sgRNA和緊接著sgRNA的PAM是決定基因編輯準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。sgRNA長20 nt，通過與靶序列互補(bǔ)配對引導(dǎo)Cas9準(zhǔn)確定位于靶基因，并在PAM上游約3 bp處進(jìn)行DNA雙鏈剪切[17]。斷裂雙鏈 (DSBs)的DNA損傷修復(fù)途徑主要有以下兩種：缺少修復(fù)模板時，斷裂雙鏈通過非同源末端連接 (Nonhomologous end joining，NHEJ)途徑重新連接，這種過程容易產(chǎn)生插入或缺失突變使基因功能喪失，因而被應(yīng)用于基因敲除；當(dāng)存在同源修復(fù)模板時，斷裂雙鏈通過同源直接修復(fù) (Homology-directed repair，HDR)途徑將修復(fù)模板重組進(jìn)斷裂部位，常被用于基因重組[20]。CRISPR-Cas9技術(shù)除了可以進(jìn)行基因敲除，還可以用于基因的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。CRISPR干擾 (CRISPR interference，CRISPRi)和RNAi功能相似，是在CRISPR技術(shù)基礎(chǔ)上改造而來的，將Cas9突變使其喪失活性 (dead Cas9，dCas9)無法對雙鏈DNA進(jìn)行切割，再與轉(zhuǎn)錄抑制因子聯(lián)合作用，即可在sgRNA指導(dǎo)下抑制特定基因的表達(dá)[26]。CRISPR激活 (CRISPR activation，CRISPRa)是利用dCas9和轉(zhuǎn)錄激活因子協(xié)作上調(diào)靶基因表達(dá)水平，可以被應(yīng)用于功能獲得型篩選[27]。

2 CRISPR-Cas9基因文庫

2.1 基因文庫設(shè)計

目前研究者們已對如何將CRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于功能性基因篩選進(jìn)行了多種嘗試并取得了成功 (表1)，為后來者提供了大量的經(jīng)驗(yàn)和指導(dǎo)。CRISPR-Cas9功能性基因篩選平臺首先需要有能夠滿足實(shí)驗(yàn)者需求的CRISPR-Cas9文庫。有效的sgRNA是決定CRISPR-Cas9功能性基因篩選成功的關(guān)鍵因素，因此首先要設(shè)計針對全基因組的sgRNA。設(shè)計sgRNA要考慮兩點(diǎn)：一是Cas9作用必需的PAM序列，二是降低脫靶效率[17]。研究者們開發(fā)了多種用于設(shè)計sgRNA的平臺。Chuai等[28]總結(jié)了當(dāng)前的36個設(shè)計sgRNA的網(wǎng)站，并根據(jù)平臺設(shè)計規(guī)則將其分為3類：1)Alignment-based：單純依據(jù)PAM位置設(shè)計及評分；2)Hypothesisdriven：依據(jù)GC含量、外顯子位置等因素對sgRNA效率的作用設(shè)計及評分；3)Learningbased：利用考慮影響sgRNA效率的不同特點(diǎn)的訓(xùn)練模式設(shè)計及評分。其中第二、三類平臺在設(shè)計時考慮了不同序列和染色質(zhì)特點(diǎn)，相比第一類平臺更加全面高效，使用者可根據(jù)不同要求選擇適合的平臺。設(shè)計好的sgRNA合成后需要連接至合適的慢病毒載體上，Cas9核酸酶既可以和sgRNA構(gòu)建在同一個質(zhì)粒上[29]，也可以構(gòu)建在兩個質(zhì)粒上[30]。將構(gòu)建好的sgRNA文庫包裝成慢病毒，并以低MOI(通常為0.3–0.5)感染細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株[29]，避免同一細(xì)胞多個基因同時被敲除對結(jié)果造成影響。

2.2 常用篩選方式

CRISPR-Cas9文庫高通量篩選常用模式可以分為陽性篩選 (Positive selection screen)和陰性篩選 (Negative selection screen)[30]。陽性篩選是對已成功整合sgRNA的細(xì)胞文庫施加一定的篩選壓力，僅使少數(shù)目的表型的細(xì)胞能夠存活，達(dá)到富集關(guān)鍵基因的目的。陰性篩選與之相反，存活的細(xì)胞并不是目的表型細(xì)胞，因此需要比較不同時間點(diǎn)sgRNA的豐度找出差異sgRNA來確定關(guān)鍵基因。兩種篩選方式通常都需要與高通量測序技術(shù)結(jié)合，通過高通量測序獲得樣品中細(xì)胞的sgRNA序列信息，再通過生物信息學(xué)分析排除假陽性結(jié)果繼而確定可能的候選基因 (圖 1)。CRISPR系統(tǒng)后續(xù)分析同樣是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要問題，Chuai等[28]同樣整理了7種用于后續(xù)結(jié)果分析的平臺。例如MAGeCK是Li等[31]開發(fā)的用來分析CRISPR高通量篩選結(jié)果的算法，之后Li等又將其拓展為MAGeCK-VISPR算法[32]，為CRISPR高通量篩選提供了綜合質(zhì)控、分析及可視化的數(shù)據(jù)分析方法。

表1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在功能基因篩選中的應(yīng)用Table 1 Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system

3 CRISPR-Cas9文庫應(yīng)用于功能性基因篩選的研究進(jìn)展

3.1 藥物作用基因篩選

圖1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)功能基因篩選流程Fig.1 Flowchart of functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system.

CRISPR-Cas9文庫早期應(yīng)用于藥物作用基因篩選的嘗試較多。Vemurafenib是突變的蛋白激酶BRAF的抑制劑，被批準(zhǔn)用于晚期黑色素瘤的治療，對存在V600E BRAF突變的黑色素瘤有治療效果。Shalem等[29]設(shè)計了靶向全基因組18080個基因，包含64751條sgRNA的CRISPR-Cas9基因敲除文庫，并命名為GeCKO(Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout)文庫。Shalem等利用慢病毒載體將GeCKO文庫轉(zhuǎn)染進(jìn)有V600E BRAF突變的黑色素瘤細(xì)胞A375中，加入Vemurafenib抑制A375細(xì)胞生長，從而富集少數(shù)具有Vemurafenib藥物抗性的細(xì)胞。通過對這部分細(xì)胞的sgRNA序列進(jìn)行分析，Shalem等篩選出了nf1、med12、nf2、cul3、tada2b和tada1等敲除后能夠使細(xì)胞對Vemurafenib產(chǎn)生抗性的基因，其中nf2、cul3、tada2b和tada1之前尚未被報道過與Vemurafenib耐藥性有關(guān)。這些候選基因提出了新的Vemurafenib腫瘤耐藥機(jī)制假說。研究者還將篩選結(jié)果與之前使用RNAi[33]篩選Vemurafenib耐藥基因的結(jié)果進(jìn)行比較評估，兩者結(jié)果高度一致，證明了CRISPR-Cas9用于功能性基因篩選的可行性。

同期，Wang及其團(tuán)隊也采用了類似的篩選方式研究了DNA錯配修復(fù)的相關(guān)基因[34]。研究者使用能夠引起細(xì)胞損傷的核苷類似物6-硫代鳥嘌呤作為篩選抗性，MMR通路正常的細(xì)胞無法修復(fù)6-硫代鳥嘌呤引起的損傷而導(dǎo)致細(xì)胞滯留在G2-M期無法進(jìn)行正常的分裂，而MMR缺陷細(xì)胞則不能識別這種損傷從而繼續(xù)進(jìn)行分裂。Wang等設(shè)計合成了靶向7114個基因的sgRNA文庫，并且每個基因至少設(shè)計了10條sgRNA以確保文庫的knockout效率。與Shalem的方法略有差別的是，Wang等并未采用單質(zhì)粒的慢病毒載體系統(tǒng)，而是先構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Cas9的KBM7細(xì)胞，再轉(zhuǎn)染了整個sgRNA文庫。與單質(zhì)粒系統(tǒng)相比，雙質(zhì)粒系統(tǒng)可以通過挑選高效的Cas9表達(dá)細(xì)胞株來提高文庫的knockout效率。完成建庫工作后研究者利用6-硫代鳥嘌呤的細(xì)胞致死作用，殺死MMR通路正常細(xì)胞，富集MMR通路突變細(xì)胞。對存活細(xì)胞的sgRNA測序分析，研究者發(fā)現(xiàn)被富集細(xì)胞的sgRNA主要靶向MMR通路的4個關(guān)鍵基因msh2、msh6、mlh1和pms2。

sgRNA文庫的構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)功能性基因篩選的關(guān)鍵。覆蓋全基因的文庫雖然更加全面，但是由于庫容量龐大，在實(shí)際操作過程中需要大量的細(xì)胞，工作量及操作難度均較大。在研究炭疽毒素與白喉毒素毒性作用相關(guān)基因的工作中，Zhou等[35]通過對已掌握知識進(jìn)行整理，挑選出了可能與研究內(nèi)容相關(guān)的291基因，并設(shè)計了靶向這291個基因的包含869條sgRNA的慢病毒聚焦型人源文庫。該課題組使用炭疽毒素和白喉毒素分別進(jìn)行陽性篩選，經(jīng)過三輪毒素處理，待對照組細(xì)胞全部死亡后，對實(shí)驗(yàn)組存活細(xì)胞進(jìn)行測序分析。除了已知的炭疽毒素受體Antxr1，研究者還成功鑒定plxna1、pecr、fzd10和CD81等與炭疽毒素作用機(jī)制相關(guān)的基因。已知白喉毒素相關(guān)基因hbegf及新的與白喉毒素相關(guān)基因rab2a也被富集。這種聚焦型的文庫縮小了篩選范圍，降低了操作難度和實(shí)驗(yàn)成本，尤其適用于研究者對篩選功能基因已有一定了解的情況。根據(jù)實(shí)際情況選擇適合的文庫容量能夠更有效地進(jìn)行文庫篩選工作，提高實(shí)驗(yàn)成功率。

3.2 腫瘤功能基因篩選

腫瘤是機(jī)體在遺傳及環(huán)境等多重因素的影響下，致癌基因和抑癌基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的細(xì)胞生長不受調(diào)控的疾病，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，引起了科學(xué)家的高度重視。運(yùn)用高通量篩選技術(shù)鑒別參與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因是研發(fā)抗腫瘤新藥的重要手段。CRISPR文庫也被應(yīng)用于腫瘤治療靶點(diǎn)和新型抗腫瘤藥物篩選，取得了良好的成果。

胰腺癌生長快、轉(zhuǎn)移率高且預(yù)后差，被稱為“癌中之王”，其中胰腺導(dǎo)管腺癌 (PDA)是胰腺癌的一個主要的類型。Steinhart等[36]選取了一株RNF43突變的胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞 (PDAC)HPAF-Ⅱ來篩選胰腺癌新的治療靶標(biāo)。Steinhart及其團(tuán)隊中將靶向全基因組17232個基因的TKO gRNA文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)HPAF-Ⅱ細(xì)胞，通過對不同時間點(diǎn)細(xì)胞的sgRNA的豐度變化進(jìn)行分析從而鑒別影響細(xì)胞增殖的基因。Steinhart等鑒別出了2174個影響HPAF-Ⅱ細(xì)胞增殖的基因，其中參與Wnt信號通路的FZD5，對PDAC的增殖具有重要的意義。隨后研究者還發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)合FZD5和FZD8的抗體能夠抑制RNF43突變PDAC細(xì)胞生長，在腫瘤異種移植模型中也有類似作用，并且對RNF43突變的結(jié)直腸癌也有抑制效果。因此Steinhart等提出FZD5可以作為胰腺癌的潛在治療靶點(diǎn)，基于CRISPR的高通量功能性基因篩選是篩選細(xì)胞表面特異性治療靶標(biāo)的有效手段。

一些抗腫瘤藥物僅對發(fā)生特異性基因突變的細(xì)胞起作用，其作用機(jī)制是當(dāng)腫瘤細(xì)胞中某個基因發(fā)生突變時抑制另一基因表達(dá)，因而能夠特異性地殺傷突變率高的腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞，這一作用方式被稱為合成致死性。Shen等[37]從這一思路出發(fā)，設(shè)計了雙重gRNA文庫篩選合成致死相互作用網(wǎng)絡(luò)。與一般的sgRNA文庫不同，雙重gRNA文庫中每個載體包含兩條gRNA，一條靶向腫瘤細(xì)胞中高突變的腫瘤抑制基因，另一條靶向一種能夠被腫瘤治療藥物抑制的基因。Shen等設(shè)計了靶向73對癌癥基因，共計141912種基因組合的雙重gRNA文庫，并在人宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞中進(jìn)行了篩選，通過檢測不同時間點(diǎn)gRNA豐度變化，進(jìn)一步分析篩選出120種合成致死相互作用，為癌癥新藥的開發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。

CRISPR-Cas9功能性篩選技術(shù)也是研究腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的重要工具之一。Chen等[38]用包含67405條sgRNA的基因文庫誘變處理一種非轉(zhuǎn)移的鼠非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，并將其移植于免疫缺陷鼠身上，發(fā)現(xiàn)腫瘤很快就出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移。Chen等將肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞與原發(fā)部位細(xì)胞進(jìn)行測序比較sgRNA豐度變化，篩選出nf2、pten、cdkn2a、trim72、fga、miR-345及miR-152七個與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。Chen等的工作證明了CRISPR-Cas9全基因組篩選不僅可以在各種細(xì)胞中開展，并且在體內(nèi)也同樣適用。Chen及其團(tuán)隊所提供的完整的體內(nèi)篩選方案在之后也被更廣泛地應(yīng)用于各種疾病的體內(nèi)研究工作。與體外篩選相比，動物體內(nèi)篩選模型具有更復(fù)雜的微環(huán)境，比體外更接近真實(shí)的腫瘤微環(huán)境，從而有可能篩選到依賴于腫瘤微環(huán)境的腫瘤抑制基因。

3.3 病毒感染基因篩選

許多疾病都與病毒感染相關(guān)，篩選出病毒受體或病毒在宿主細(xì)胞中復(fù)制關(guān)鍵基因有助于開發(fā)新的傳染病預(yù)防及治療策略。西尼羅病毒 (West Nile virus，WNV)是一種腦炎病毒，能夠引起急性神經(jīng)感染并導(dǎo)致大量神經(jīng)元細(xì)胞死亡。為了研究WNV導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制，Ma及其團(tuán)隊[39]構(gòu)建了靶向人類基因組20121個基因的sgRNA文庫，并將每條sgRNA的靶點(diǎn)都設(shè)計在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近以確保基因能夠被完全敲除。Ma等將構(gòu)建好的文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)293FT細(xì)胞中，并感染W(wǎng)NV病毒株進(jìn)行了第一輪篩選。Ma等對第一輪篩選結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有部分豐度較高的sgRNA其靶向基因的其他sgRNA并未被富集，這些結(jié)果可能是由假陽性造成的。因此Ma及其團(tuán)隊又針對初次實(shí)驗(yàn)結(jié)果富集到的sgRNA設(shè)計了亞基因敲除文庫進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終篩選出7個與WNV誘導(dǎo)細(xì)胞死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因：emc2、emc3、sel1l、derl2、ubeg2、ube2j1和hrd1。研究者證實(shí)了敲除這些基因能夠有效保護(hù)細(xì)胞不被WNV殺死，這7個基因可以作為新的治療靶點(diǎn)以降低WNV導(dǎo)致的機(jī)體損傷。

HIV引發(fā)的艾滋病 (AIDS)嚴(yán)重威脅著人類生命健康，闡明HIV突破宿主細(xì)胞防御系統(tǒng)的分子機(jī)制，開發(fā)HIV治療的新靶點(diǎn)，進(jìn)而提出新的HIV防治策略，具有非常重大的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價值。Park等[40]為了闡明HIV在T細(xì)胞上的受體，設(shè)計了適用于CRISPR篩選的CD4+T細(xì)胞(GXRCas9細(xì)胞)篩選模型，并用包含187536條sgRNA(靶向18543個基因)的慢病毒文庫感染該細(xì)胞，獲得了超過18萬種缺失不同受體的T細(xì)胞庫。之后研究人員用HIV病毒株JR-CSF感染這些缺失不同受體的T細(xì)胞，隨后通過流式分選GFP陰性和陽性的T細(xì)胞 (被病毒感染的細(xì)胞能夠檢測到GFP的表達(dá))，并對GFP陰性細(xì)胞群與未感染HIV病毒細(xì)胞測序，分析兩群細(xì)胞sgRNA的豐度差異，最終發(fā)現(xiàn)了5個sgRNA豐度變化最大的基因。其中CD4和CCR5是HIV感染T細(xì)胞的受體，酪蛋白磺基轉(zhuǎn)移酶2(Tyrosylprotein sulfotransferase 2，TPST2)和溶質(zhì)家族35成員B2(Solute carrier family 35 member B2，SLC35B2)對CCR5進(jìn)行修飾以便于與HIV結(jié)合。另一種基因編碼白細(xì)胞粘附因子 (Activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM)，與HIV在細(xì)胞間的傳播相關(guān)。篩選出的5個基因被敲除后均不影響T細(xì)胞的存活，但能夠使T細(xì)胞抵抗HIV的感染，因此可以作為HIV治療的潛在靶標(biāo)，為預(yù)防和治療艾滋病提供新的理念和途徑。

目前功能缺失型 (Loss-of-function)篩選已被廣泛應(yīng)用于尋找病毒感染、復(fù)制和傳播所需基因，但過表達(dá)基因影響病毒感染的研究還比較欠缺。基于此Heaton等[41]應(yīng)用CRISPR協(xié)同激活調(diào)節(jié)(CRISPR synergistic activation mediator，CRISPR SAM)技術(shù)篩選過表達(dá)后抑制甲型流感病毒 (IVA)感染的基因。研究者首先將dCas9-VP64融合蛋白和MS2-p65-HSF1轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)A549-CR細(xì)胞中，并將靶向全基因組23430個基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游200 bp處的sgRNA文庫導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄激活效率最高的細(xì)胞株，促進(jìn)基因的過表達(dá)。之后研究者用IVA感染細(xì)胞，通過流式分選出未被病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)靶向b4galnt2基因的sgRNA豐度最高。經(jīng)過多重驗(yàn)證，Heaton等證明了b4galnt2過表達(dá)能夠限制多種亞型的甲型流感病毒感染，未來可能被應(yīng)用于防治人流感及禽流感。

為了研究影響溶瘤病毒感染及殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵基因，我們同樣采用基于GeCKO v2全基因組敲除文庫的功能缺失型 (Loss-of-function)篩選方法。我們嘗試了兩種篩選方案：第一種是陣列篩選 (Arrayed screen)，即將已成功轉(zhuǎn)導(dǎo)GeCKO v2文庫的病毒抵抗型細(xì)胞分入96孔板，通過免疫斑點(diǎn)法檢測病毒復(fù)制情況，挑選病毒復(fù)制提高的孔進(jìn)行下一步驗(yàn)證；第二種方法是合并篩選 (Pooled screen)，即將成功轉(zhuǎn)導(dǎo)GeCKO v2文庫的細(xì)胞感染病毒，利用高通量測序分析病毒感染后細(xì)胞sgRNA豐度變化情況。與合并篩選相比，陣列篩選每孔細(xì)胞數(shù)較少，因此在培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)sgRNA丟失的情況，同時實(shí)驗(yàn)結(jié)果還與用于檢測病毒復(fù)制抗體的親和性有關(guān)，容易出現(xiàn)假陽性，降低了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，且該方法工作量較大，操作難度高。合并篩選是較為便捷準(zhǔn)確的篩選方式，需要注意的是篩選所用細(xì)胞的選擇，可依據(jù)正向篩選和負(fù)向篩選分別選擇病毒敏感型細(xì)胞和病毒抵抗型細(xì)胞。

3.4 非編碼基因功能研究

基因組中大多數(shù)DNA并不編碼蛋白質(zhì)，但卻與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，研究表明超過90%遺傳變異相關(guān)疾病發(fā)生在基因非編碼區(qū)域[42]。闡明這些非編碼基因如何參與基因表達(dá)調(diào)控有助于人們更好地研究基因異常導(dǎo)致的疾病。在之前的工作中，Shalem等[29]利用CRISPR-Cas9文庫發(fā)現(xiàn)了nf1、nf2、clu3等功能缺失后使黑色素瘤細(xì)胞對Vemurafenib產(chǎn)生抗性的基因。在此基礎(chǔ)上，Sanjana等[43]設(shè)計了3個分別靶向cul3、nf1和nf2基因5′端和3′端緊鄰的100 kb范圍內(nèi)基因區(qū)域的sgRNA文庫，來研究非編碼區(qū)對相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制。Sanjana等將sgRNA文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)BRAF突變的A375細(xì)胞中，將Vemurafenib處理后的存活細(xì)胞測序分析。研究者對富集sgRNA最多的cul3基因進(jìn)行了重點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)在cul3基因周圍有24個基因位點(diǎn)突變能夠?qū)е耤ul3表達(dá)降低。Sanjana及其團(tuán)隊的工作證明了CRISPR-Cas9文庫不僅可以用于篩選功能性基因，還可以用來研究非編碼基因功能。

對于非編碼長鏈RNA(lncRNA)，插入或缺失突變導(dǎo)致的變化可能并不足以產(chǎn)生明顯的表型變化。針對這一情況，Zhu等[44]設(shè)計了配對向?qū)NA(Paired-guide RNA，pgRNA)，對人肝癌細(xì)胞系Huh7.5OC中的近700個癌癥或其他疾病相關(guān)長鏈非編碼RNA的基因進(jìn)行了功能篩選。pgRNA是一對靶向不同位點(diǎn)的sgRNA，能夠在同一基因的不同位點(diǎn)造成雙鏈斷裂，因此有可能產(chǎn)生大片段的缺失，造成可觀察的表型變化。為了驗(yàn)證pgRNA的有效性，研究人員設(shè)計了靶向cspg4基因座的pgRNA，使用雙U6啟動子分別啟動兩個gRNA的表達(dá)，結(jié)果表明所有的6對pgRNA均能夠?qū)蛘_切割。基于此，Zhu等針對Huh7.5OC中的近700個癌癥或其他疾病相關(guān)長鏈非編碼RNA設(shè)計了gRNA，剔除其中特異性和效率較低的gRNA及靶向啟動子和外顯子的gRNA，獲得了可用于篩選的基因文庫。之后研究者將文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)穩(wěn)定表達(dá)Cas9的Huh7.5OC，持續(xù)培養(yǎng)30 d后對CRISPR篩選前和篩選后的細(xì)胞測序分析來鑒定能夠影響細(xì)胞增殖和生存的lncRNA。經(jīng)過多重的驗(yàn)證，Zhu等鑒定出了51個與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的非編碼RNA，證實(shí)了利用pgRNA研究lncRNA的方法具有較高的精確性和特異性。同時，研究人員在Hela細(xì)胞中的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。但是這一篩選策略仍存在一些問題。首先刪除lncRNA可能影響鄰近功能元件如增強(qiáng)子和microRNA的功能，因此需要在設(shè)計pgRNA時盡可能地排除靶向增強(qiáng)子和microRNA區(qū)域的gRNA。由于pgRNA間具有相同的U6啟動子和3′支架序列，不同的pgRNA間有可能 (約7.5%)會發(fā)生重組導(dǎo)致錯誤的配對，使用不同的U6啟動子和3′支架序列可以降低重組率。此外，這種篩選策略并不能揭示lncRNA的調(diào)節(jié)機(jī)制，還需要后續(xù)的工作進(jìn)行探究。

Klann及其團(tuán)隊[45]介紹了一種以CRISPRCas9技術(shù)為基礎(chǔ)的表觀遺傳調(diào)節(jié)元件篩選方法(CERES)。識別調(diào)節(jié)元件所有可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)需要針對該調(diào)節(jié)元件區(qū)域設(shè)計高密度的sgRNA。然而在許多基因區(qū)域PAM序列可能并不在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致sgRNA不能充分覆蓋所有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。因此Klann等選用了轉(zhuǎn)錄抑制的dCas9KRAB酶和轉(zhuǎn)錄激活的dCas9p300酶。dCas9KRAB 是將 KRAB(Krüppelassociated box)區(qū)域與dCas9融合表達(dá)，招募使組蛋白H3K9發(fā)生甲基化的蛋白進(jìn)而形成異染色質(zhì)導(dǎo)致靶序列上的基因抑制[46]。E1A相關(guān)蛋白p300組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶核心區(qū)與dCas9融合后能夠結(jié)合到靶DNA增強(qiáng)子或啟動子上，促進(jìn)組蛋白H3K27發(fā)生乙酰化，從而促使基因激活[47]。這兩種方法即使在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)沒有PAM序列的情況下仍然能夠?qū)φ{(diào)節(jié)元件活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究人員根據(jù)人白血病細(xì)胞系K562 DNase-seq數(shù)據(jù)設(shè)計了針對b-globin基因座周圍4.5 Mb區(qū)域的10739條sgRNA。這些sgRNA靶向該區(qū)域281個DNaseⅠ超敏感位點(diǎn) (DNaseⅠhypersensitive sites，DHSs)。研究者將構(gòu)建好的sgRNA導(dǎo)入改造過的細(xì)胞 (b-globin的轉(zhuǎn)錄與熒光蛋白相關(guān)聯(lián))中，并分別將熒光表達(dá)最高和最低的10%細(xì)胞分選出來分析sgRNA的相對豐度變化。Klann及其團(tuán)隊的工作為高通量注釋調(diào)節(jié)元件的作用提高了效率。

3.5 其他工作

除了應(yīng)用于腫瘤、病毒、非編碼RNA的相關(guān)功能基因研究外，CRISPR-Cas9高通量篩選在抗體靶標(biāo)篩選、細(xì)胞信號通路研究等生物醫(yī)學(xué)的其他領(lǐng)域中也有著廣泛的應(yīng)用。

單克隆抗體特異性靶標(biāo)抗原及其表位的識別是抗體研究中的重要工作。傳統(tǒng)的抗原特異性鑒別方式是Western blotting(蛋白印跡)和Immunoprecipitation(免疫沉淀)，但是當(dāng)抗體不能被Western blotting和Immunoprecipitation檢測到時，就需要使用基于基因的技術(shù)來鑒定抗體靶標(biāo)。Zotova等[48]以MT2細(xì)胞 (人T細(xì)胞嗜淋巴病毒Ⅰ型HTLV-1慢性感染T細(xì)胞)作為免疫原免疫小鼠獲得了一株HTLV-1生物膜特異性單克隆抗體BF4。BF4能夠和未感染的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及HTLV-1感染細(xì)胞表面的病毒生物膜結(jié)合。Zotova等的研究思路是在BF4陽性細(xì)胞上轉(zhuǎn)導(dǎo)CRISPR knockout文庫，分選出陰性細(xì)胞，即可能是BF4抗原被敲除的細(xì)胞?；谶@樣的思路研究者在CEM T和Raji/CD4 B細(xì)胞上轉(zhuǎn)導(dǎo)GeCKO文庫，并將不與BF4結(jié)合的細(xì)胞分選出來。經(jīng)過兩輪的重復(fù)分選，陰性細(xì)胞比例達(dá)到了99%以上。研究人員對這部分細(xì)胞進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)約80%的sgRNA靶向CD82，經(jīng)過驗(yàn)證，證實(shí)了BF4確實(shí)是CD82特異性抗體。在篩選抗體靶標(biāo)的研究中還有一些需要注意的地方，首先這種篩選方式不適合篩選抗體抗原是細(xì)胞生存所需的基因，因?yàn)檫@部分基因被敲除后會導(dǎo)致細(xì)胞無法存活而丟失，無法在后續(xù)的分選工作中被鑒定出。Cas9文庫的代表性和多樣性也是需要關(guān)注的問題，不同的細(xì)胞和慢病毒載體都會對此造成影響。

Shi及其團(tuán)隊[49]在Nature上發(fā)表了關(guān)于細(xì)胞焦亡機(jī)制的相關(guān)研究。細(xì)胞焦亡是機(jī)體在感知病原微生物浸染后啟動的免疫防御反應(yīng)，炎癥激活的caspase-1和識別細(xì)菌脂多糖的caspase-4、caspase-5和caspase-11都能夠引起細(xì)胞焦亡，但是其機(jī)制仍然未知。研究人員首先建立了脂多糖(LPS)電轉(zhuǎn)方法，使LPS能夠誘導(dǎo)90%以上的細(xì)胞焦亡。接著在能夠?qū)χ嗵谴碳ふ７磻?yīng)的Tlr4–/–骨髓源永生化巨噬細(xì)胞 (iBMDMs)轉(zhuǎn)導(dǎo)CRISPR knockout基因文庫，將脂多糖刺激細(xì)胞焦亡后存活的細(xì)胞測序分析。分析結(jié)果顯示，靶向gasdermin D(GSDMD)基因的5條sgRNA中，有4條在富集到的前30中，其中有2條在前10。后續(xù)的結(jié)果進(jìn)一步證明了GSDMD的N端能夠誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。在此研究中，研究人員利用CRISPR基因文庫進(jìn)行了全基因組范圍的遺傳篩選，成功地篩選到了敲除后能夠抑制細(xì)胞焦亡的基因GSDMD，并闡明了GSDMD作為炎癥caspase底物蛋白，在被切割后能夠引發(fā)細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制。

4 結(jié)語

CRISPR-Cas9技術(shù)作為近年來熱門的基因編輯技術(shù)，憑借其精準(zhǔn)、簡便、高效的特點(diǎn)受到眾多研究者的關(guān)注，短短幾年間已成為基因編輯領(lǐng)域中最熱門的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?；贑RISPR-Cas9的高通量功能性篩選技術(shù)也逐漸取代了RNAi和cDNA文庫，為功能基因的研究提供了高通量高效率的篩選工具。盡管與傳統(tǒng)的篩選方法相比，CRISPR-Cas9更加高效可靠且特異性更高，但其仍然存在一些問題，其中最令人關(guān)注的就是脫靶效率。CRISPR-Cas9系統(tǒng)依據(jù)20 nt的sgRNA定位靶基因，因此有可能由于錯配而出現(xiàn)脫靶問題。除了設(shè)計特異性更高的sgRNA外，研究者們提供了其他的降低脫靶效率的策略。例如可以使用只切開DNA雙鏈一側(cè)的Cas9n切口酶[50]，需要一對sgRNA才能完成DNA雙鏈剪切，因此可以降低脫靶效率。Vidigal等[51]則是將20 nt的sgRNA縮短為17 nt，剪切效率不變而脫靶效率降低。另一種策略是將dCas9與FokⅠ核酸酶融合表達(dá)來提高篩選特異性[52]。這些方法雖然能夠降低脫靶效率，但是還需要進(jìn)一步改進(jìn)才能應(yīng)用于高通量的功能性基因篩選。

基于CRISPR-Cas9功能性基因篩選技術(shù)已經(jīng)在細(xì)胞生存必需基因鑒定、藥物或毒素抗性基因篩選、潛在治療靶標(biāo)篩選、腫瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因篩選方面取得了重要進(jìn)展，為開發(fā)有效的靶點(diǎn)特異性治療藥物奠定了基礎(chǔ)，未來也必然會推動整個生命科學(xué)的快速發(fā)展。

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