丁 赫 ，宮永勝，王 軍，呂文發(fā)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林省反芻動物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實驗室，吉林長春 130118）

初情期是指雌性動物初次發(fā)情并排出卵子的過程，是動物獲得繁殖能力的標志，其啟動時間的早晚影響著養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟效益[1-2]。下丘腦-垂體-性腺（Hypothalamic-Pituitary-Gonadal，HPG）軸在初情期啟動過程中具有重要的作用，下丘腦促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing Hormone，GnRH）脈沖式釋放，調(diào)節(jié)垂體促卵泡素和促黃體素的分泌，最終實現(xiàn)初情期的啟動[3-4]。初情期啟動的機制復(fù)雜，主要與環(huán)境、表觀遺傳機制等密切相關(guān)。DNA甲基化是目前研究較多的一種表觀遺傳修飾方式，多發(fā)生在富含CpG島和CpG位點區(qū)域，啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)影響著基因的轉(zhuǎn)錄[5-7]。有研究表明，DNA甲基化升高可抑制基因的表達[8-9]，在初情期啟動過程中DNA甲基化改變可能影響下丘腦中的特定基因的表達，從而調(diào)節(jié)初情期的啟動[10-11]。本實驗利用亞硫酸氫鹽測序（Bisulfite Sequencing PCR，BSP）技術(shù)研究了GnRH啟動子區(qū)富含CpG島和CpG位點的1 000 bp區(qū)域的甲基化狀態(tài)，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)研究了GnRHmRNA表達量，并分析初情期啟動過程中小尾寒羊下丘腦GnRH基因表達與其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存 采集初情期前（90日齡）、臨近初情期（120日齡）、初情期（130日齡）小尾寒羊的下丘腦組織，每個階段選取小尾寒羊3只，采集的下丘腦樣本為前端止于視交叉，后端止于乳頭體，樣品采集做好標記后，放入液氮中保存，待取樣結(jié)束全部置入-80℃冰箱中保存。

1.2 BSP測序 取組織樣品，利用DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國）按說明書操作進行基因組DNA提取，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用NAS-99測定樣品中DNA濃度。隨后根據(jù)樣品濃度，抽取500 μg DNA進行DNA亞硫酸氫鹽修飾，根據(jù)試劑盒EZ DNA Methylation-Gold Kit（ZYMO公司catlog D5006）進行具體操作。在Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html）上查找并下載GnRH啟動子序列，將序列在在線引物設(shè)計軟件methprimer（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi） 中轉(zhuǎn)化為亞硫酸氫鹽修飾后的序列，利用軟件Primer5設(shè)計GnRH啟動子甲基化位點擴增引物，引物序列送至北京優(yōu)博蘭基因技術(shù)有限公司進行合成，引物信息見表1。PCR擴增體系半巢式第1輪：1 μL修飾后DNA模板，1 μLGnRH-F（10 μmol/L），1 μLGnRH-OR（10 μmol/L），0.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL Mg2+（50 mmol/L），2.5 μL 10×PCR Buffer，0.1 μL Taq酶，ddH2O至25 μL。半巢式第2輪：1 μL 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物，1 μLGnRH-F（10 μmol/L），1 μLGnRH-R（10 μmol/L），0.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL Mg2+（50 mmol/L），2.5 μL 10×PCR Buffer，0.1 μL Taq酶，ddH2O至25 μL，使用Taq酶Platinum?Taq DNA Polymerase, High Fidelity（Thermocatlog11304-029）進行擴增。半巢式第1輪擴增程序：94℃ 2 min，94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 40 s、30個 循 環(huán)，72℃延伸5 min。半巢式第2輪擴增程序為：94℃ 2 min，94℃ 30 s、60℃ 降 到 53℃（ 每 個 循 環(huán) 降 1℃）30 s、72℃ 30 s、7 個循環(huán)，94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s、33個循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖檢測后，切膠，使用DNA純化回收試劑盒（天根生化科技有限公司，DP209-03）純化產(chǎn)物。利用P-Easy T1 Cloning載體連接試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司CT101-02）進行連接轉(zhuǎn)化。利用試劑盒（Omega bio-tek，美國）提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒每段序列至少選擇10個，送至北京優(yōu)博蘭基因技術(shù)有限公司進行測序，利用BiQ Analyzer對測序結(jié)果進行整理并分析甲基化狀態(tài)，每個基因甲基化程度以所測得的CpG位點的甲基化數(shù)占所測的甲基化位點總數(shù)的百分率表示。

1.3 實時熒光定量PCR檢測 采用Trizol法提取下丘腦組織的總RNA，取冷凍保存的下丘腦，提取腦組織總RNA進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于實時熒光定量PCR實驗， 根據(jù)TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，利用RNA的OD值計算反轉(zhuǎn)20 μL的cDNA所需的RNA量。本實驗所需的GnRH基因引物序列見表2。引物序列利用Prime 5.0自行設(shè)計，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，并利用PCR儀進行引物驗證，摸索引物的最適反應(yīng)條件。利用熒光定量PCR儀對初情期前、臨近初情期和初情期母羊下丘腦中GnRH基因進行定量分析，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、Forward primer 0.8 μL、Reverse primer 0.8 μL、ROX reference DyeⅡ 0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 至 20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性 30 s；95℃ 變性 5 s，40 個循環(huán)；57℃ 退火34 s，擴增40個循環(huán)；95℃ 變性15 s，57℃ 退火60 s，95℃ 變性 15 s。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.5 軟件進行χ2檢驗比較組間差異性，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 初情期啟動過程中甲基化狀態(tài) 利用BiQ Analyzer對測序結(jié)果進行整理分析，得到GnRH啟動子區(qū)靠近第1外顯子1 000 bp內(nèi)4個CpG位點甲基化狀態(tài)結(jié)果，將得到的結(jié)果繪制成空點圖（圖1-A）和柱狀圖（圖1-B）。結(jié)果表明，在初情期前到臨近初情期，甲基化狀態(tài)變化不明顯（P＞0.05）；當(dāng)?shù)竭_初情期時，GnRH啟動子所檢測區(qū)域總體甲基化水平呈降低趨勢，初情期甲基化水平達33.33%，與初情期前差異極顯著（P＜0.01）。隨著初情期的到來，在GnRH啟動子區(qū)-570位點，甲基化程度顯著降低（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，初情期啟動過程中GnRH啟動子區(qū)特定位點的甲基化水平顯著降低。

表1 甲基化位點擴增引物序列

表2 基因引物合成情況

圖 1 GnRH 基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)

2.2 初情期啟動過程GnRH基因表達量 如圖2所示，熔解曲線呈單一峰值，且峰尖而窄，未出現(xiàn)雜峰，說明擴增較好。由圖3可知，隨著初情期的啟動，GnRHmRNA表達量在下丘腦中呈上升趨勢，GnRH在初情期的 mRNA表達量與其余2個時期差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)合GnRH甲基化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著初情期的到來，GnRH甲基化呈降低趨勢，并伴隨著GnRHmRNA表達量升高。

圖2 GnRH的熔解曲線

3 討 論

圖3 GnRH的mRNA表達量

近年來，研究甲基化與基因表達量關(guān)系的報道越來越多。啟動子區(qū)CpG位點甲基化可抑制轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合，從而抑制基因的表達。CpG位點可以通過改變甲基化狀態(tài)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[7,12-13]。Lomniczi等[14]向雌性小鼠注射DNA甲基化酶抑制劑（5-AZA），發(fā)現(xiàn)實驗組陰道口開啟的時間較對照組顯著延遲，同時延遲了卵巢的成熟，說明向雌性小鼠體內(nèi)注射5-AZA抑制甲基化時，初情期啟動受到抑制。而Terasawa等[15]研究獼猴GnRH神經(jīng)元細胞成熟過程中表觀遺傳學(xué)的變化，發(fā)現(xiàn)mRNA表達量上升的同時GnRH基因5'端CpG島甲基化呈降低趨勢。同樣，Kurian等[16]通過體外培養(yǎng)GnRH神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，在體外成熟的過程中GnRHmRNA表達量顯著上升，同時GnRH5'端14個CpG位點中有8個位點甲基化水平顯著下降。GnRH甲基化狀態(tài)與mRNA表達量變化趨勢與本研究結(jié)果一致。通過利用免疫熒光雙標記技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，甲基化CpG結(jié)合蛋白（MeCP2）和GnRH在母羊下丘腦視前區(qū)和弓狀核中存在共表達，且共表達陽性細胞數(shù)在初情期顯著高于初情期前和臨近初情期，說明DNA甲基化對GnRH表達可能存在一定的影響[17]。最近宮永勝研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 1（Dnmt 1）和GnRH在下丘腦視前區(qū)和弓狀核均有表達，同樣呈現(xiàn)共表達模式（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。這些研究進一步說明了GnRH甲基化程度可能會影響著GnRHmRNA表達量，最終影響母羊初情期的啟動。

本研究對初情期啟動過程中小尾寒羊下丘腦GnRH表達量變化與其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)相關(guān)性進行了初步研究，其對初情期啟動的作用機制尚需進一步研究。

母羊初情期啟動過程中GnRH表達調(diào)控機制目前尚不清楚，DNA甲基化作為一種重要的基因表達調(diào)控方式，可能通過影響GnRH表達來調(diào)控母羊初情期的啟動。本研究結(jié)果顯示，隨著小尾寒羊初情期的啟動，GnRH基因mRNA表達量呈上升趨勢，同時GnRH啟動子區(qū)甲基化水平降低，由此可知小尾寒羊下丘腦中GnRH甲基化狀態(tài)與其基因表達量及初情期啟動有一定的關(guān)系。

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