開麗比努爾·吾布力，王姍姍，鄭永富，陳曉利，李 娜，高慶華,3，韓春梅,3*

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2. 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300）

TGF-β（Transforming Growth Factorβ，TGF-β）信號通路是刺激骨形成的旁分泌的重要信號通路，可通過 TGF-β的配體結(jié)合 II型 TGF-β受體（TβRII），然后招募磷酸化的 I 型 TGF-β受體（TβRI），調(diào)節(jié)下游信號因子 Smads。I 型 TGF-β受體為 ALK1和ALK5，分別激活不同的 Smads，TβRII-ALK5 復(fù)合體激活Smad2/3，TβRII-ALK1復(fù)合體激活Smad1/5/8。接著活化的TGF-β受體I 激酶磷酸化Smad2/3，磷酸化Smad2/3與Smad4 結(jié)合形成的復(fù)合體入核，調(diào)控下游基因表達。研究證實其家族基因BMP2[3]、TGF-β1[4-5]均能夠誘導(dǎo)細胞二型膠原的分泌促進軟骨形成。Wnt/β-catenin 信號通路在機體發(fā)育、細胞分化、疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性已被廣泛認可。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路與TGF-β誘導(dǎo)的軟骨發(fā)育及成熟密切相關(guān)[6]。磷酸化Smad3/Smad4復(fù)合體入核可以與Wnt信號通路核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控樞紐TCF/LEF（T-cell Factor /Lymphoid Enhancer Factor）的緊密相關(guān)并協(xié)同激活特定靶基因[7]。

GyurjánIstván等[8]利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)赤鹿鹿茸MSCs及軟骨組織有TGF-β與Wnt信號通路基因表達。在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在馬鹿鹿茸不同組織中均有Wnt信號通路的下游基因c-myc的表達[9]。關(guān)于兩信號通路對鹿茸發(fā)育過程中的MSCs的軟骨分化的調(diào)控影響，目前尚無相關(guān)報道。本實驗利用TGF-β信號刺激，檢測鹿茸MSCs的軟骨分化效果，通過定量PCR技術(shù)檢測Wnt家族生長因子及信號通路基因的表達變化，初步分析TGF-β與Wnt信號通路對鹿茸生長發(fā)育的影響，為鹿茸生長與再生機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選擇飼養(yǎng)于新疆塔里木大學(xué)試驗站3～4歲的成年塔里木馬鹿2頭，當(dāng)其鹿茸生長期滿60 d時，于06:00—07:00用眠乃寧吹管麻醉。待其躺倒處于麻醉狀態(tài)，用草繩扎緊鹿茸根部以防失血過多，手工鋸沿茸根部鋸掉整支茸，快速清洗干凈組織表面污物，帶回實驗室，用手術(shù)刀取距鹿茸頂端5 cm長的部分組織，縱剖，在解剖顯微鏡下分離間充質(zhì)細胞層，盡量切去與茸皮層與成軟骨細胞層過渡的部分。按文獻[10]方法進行原代和傳代培養(yǎng)，實驗用第2代塔里木馬鹿鹿茸MSCs（P2）進行軟骨分化實驗。

1.2 試劑和儀器 胎牛血清FBS、細胞培養(yǎng)液DMEM、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、TGF-β1均為Sigma公司產(chǎn)品，阿利新藍染色試劑盒，茜素紅（北京博奧）。RIPA Lysis Buffer System（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA），BCA 蛋白試劑盒（Gefan, Shanghai，China），Anti-DKK1 兔單克隆抗體（Acros Organics，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA），Anti-β-catenin兔單克隆抗體（Cayman Chemical，Ann Arbor，MN，USA），Anti-GAPDH 兔單克隆抗體（Abcam,Cambridge，MA，USA）、DAB coloring kit（ZSGB-Bio，Beijing，China）。TRIZOL（Invitrogen），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermoFisher），定量PCR試劑盒（Roche），DMSO。CO2加濕培養(yǎng)箱（MCO-15A），Eppendorplex熒光定量PCR儀，倒置相差顯微鏡（Nikon），低溫高速離心機（Jouan），生物顯微鏡（舜宇），核酸濃度測定儀（Nanodrop ND-2000），血細胞計數(shù)板，無菌操作臺等。

1.3 實驗方法

1.3.1 塔里木馬鹿鹿茸MSCs擴大培養(yǎng)及軟骨誘導(dǎo)分化 選擇5個6孔板，每個孔中加入1 mL 10% FBSDMEM，約含細胞1×105個。設(shè)置其中15孔為對照組，另15孔為誘導(dǎo)組。誘導(dǎo)組每孔于接種P2細胞后第3天，細胞生長至70%融合時，換用軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，即含10 ng/mL TGF-β1 的 10% FBS-DMEM 及 1×10-7mol/L地塞米松。每2 d半量換液。換液時在倒置顯微鏡下觀察拍照記錄細胞生長情況。在培養(yǎng)至第7、14、21、28、35天時，每個時間點分別收集3個孔的細胞，每孔細胞數(shù)約為4.5×105個，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。利用阿利新藍、茜素紅染色方法鑒定分化過程表面標(biāo)志物的特征性變化，鑒定軟骨誘導(dǎo)分化的結(jié)果，方法見王姍姍等[11]。

1.3.2 Wnt家族基因表達的定量檢測

1.3.2.1 RNA提取及cDNA第1鏈合成 收集誘導(dǎo)MSCs 5個時間點的細胞，共30個樣本，用Invitrogen公司的 TRIZOL Reagent?RNA提取試劑盒提取RNA，使用Thermo Fisher公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，總反應(yīng)體系為 20 μL：9.5 μL 無 RNA 酶水，1.5 μL Oligo（dT），1 μL RNA（調(diào)整濃度為1 μg/μL），離心混勻后，65℃ 5 min，立即冰浴2 min，加入1.2 μL RNA酶抑制劑，1 μL MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶，3.8 μL 5×Buffer，2 μL dNTP，42℃1 h后，70℃ 5 min，即得cDNA第1鏈。

2) 三級數(shù)量彈性契約的供應(yīng)鏈在價格隨機或是價格穩(wěn)定的突發(fā)事件下顯現(xiàn)出來的規(guī)律性質(zhì)大體相同.它們的主要區(qū)別是：價格隨機情景下批發(fā)價調(diào)整的幅度、供應(yīng)鏈上企業(yè)的期望收益變化的比率，要比價格穩(wěn)定的情況要大一些.由此可見，價格隨機的突發(fā)事件對供應(yīng)鏈系統(tǒng)的影響較大，企業(yè)需要采取定特定的手段以消除突發(fā)事件的影響.

1.3.2.2 基因表達量檢測 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的牛Wnt家族生長因子基因序列和內(nèi)參基因GAPDH基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計PCR的引物（表1）。所有cDNA樣本1:10稀釋后，首先利用半定量PCR反應(yīng)條件：95℃，5 min，（95℃，10 s；65℃，30 s，72℃，2 min）×28個循環(huán)，檢測引物的設(shè)計效果及反應(yīng)條件，然后利用qPCR反應(yīng)條件為95℃，5 min，（95℃，10 s；60℃， 30 s）×40個循環(huán)，熔解曲線程序：55～95℃，檢測鹿茸MSCs軟骨分化過程基因的表達變化。

1.3.2.3 Western blot 誘導(dǎo)MSCs 5個時間點的細胞，用PBS洗3 次，每個培養(yǎng)孔加200 μL RIPA細胞裂解液，充分裂解后按BCA 蛋白檢測試劑盒方法提取蛋白。將提取到的蛋白樣本按4:1 與蛋白緩沖液混合均勻煮沸5 min。用12% SDS-PAGE膠分型后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，用TBST（TBS加0.05% Tween-20）漂洗10 min×3 次，一抗 DKK1、β-catenin及內(nèi)參GAPDH（1:200）4℃分別孵育過夜后，用TBST漂洗10 min×3 次，HRP 標(biāo)記抗兔二抗（羊抗兔IgG辣根酶標(biāo)記，1:3 000）室溫孵育2 h，用TBST漂洗10 min×3 次；將DAB顯色試劑盒的A、B液體按照1:20混勻后，加至PVDF膜上，靜止1～5 min，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照記錄。

1.4 統(tǒng)計分析 不同時間點基因的相對表達量均與相應(yīng)對照組鹿茸MSCs的表達量比較，表達倍增值用2-△△Ct法計算，具體計算公式：

目的基因的 mRNA 表達量 =-[（ct試驗組目的基因-ct內(nèi)參基因）-（ct對照組目的基因-內(nèi)參基因）]

利用SPSS 17.0 軟件One-Way ANOVA對不同時間點基因表達差異進行顯著性檢驗。采用配對t檢驗法對對照組和誘導(dǎo)組的基因表達差異進行顯著性檢驗。P＜0.05條件下差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取 由圖1可見，1.2%瓊脂糖電泳后檢測，RNA的28S、18S、5S 3條帶完整。核酸濃度測定儀（Nanodrop ND-2000）測定，其RNA平均濃度為0.843 μg/μL，OD260/OD280值1.7左右?？捎糜谙乱徊綄嶒?。

圖1 細胞RNA提取結(jié)果

2.2 1 0 ng/mL TGFβ1刺激鹿茸MSCs軟骨分化過程COLⅠ和COLⅡ基因的表達變化 從TGFβ1刺激第7、14、21、28、35天，COLⅠ基因呈下調(diào)表達趨勢（圖2-A），COLⅡ基因在TGFβ1刺激第21天表達量顯著高于其他時間點（圖2-B）。與表面標(biāo)志物檢測結(jié)果一致。

2.3 1 0 ng/mL TGFβ1刺激鹿茸MSCs軟骨分化過程Wnt信號基因表達 利用PCR方法對16個Wnt家族生長因子在 TGFβ1刺激的第7、14、21、28、35天5個時間點的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)僅有Wnt3，Wnt4和Wnt5A3個基因有表達。Wnt3與Wnt5A的表達趨勢相近，在刺激后的第21天，軟骨發(fā)育高峰期的表達量顯著高于分化前和分化后（圖3），該結(jié)果與鹿茸MSCs軟骨分化的進程相一致，初步推測Wnt3與Wnt5A的表達對鹿茸軟骨的發(fā)育有重要的影響。Wnt4基因表達呈上調(diào)表達趨勢（圖3），在軟骨與骨的形成過程表達量逐漸上升，初步說明其對軟骨及軟骨骨化有重要的影響。

圖2 COL I和COL Ⅱ基因在誘導(dǎo)鹿茸MSCs的第7、14、21、28、35天 5個時間點的表達量

圖3 Wnt3、Wnt4和Wnt5A在誘導(dǎo)軟骨分化過程的表達變化

Wnt信號的胞漿內(nèi)傳導(dǎo)系統(tǒng)的DKK1基因是信號通路的抑制因子。從第7～21天，DKK1基因的表達量逐漸上升直至軟骨發(fā)育的高峰期（圖4）；β-catenin基因是信號通路的樞紐，在誘導(dǎo)的第14天，MSC細胞分化初期的表達量顯著高于其他時間點，而在鹿茸軟骨發(fā)育的第21天表達下調(diào)，初步推測在鹿茸軟骨發(fā)育時期DKK1對Wnt信號通路有阻抑作用，DKK1基因?qū)β谷譓SCs軟骨的分化進程有顯著影響。

3 討 論

圖4 DKK1在誘導(dǎo)軟骨分化過程的的表達變化

圖5 β-catenin在誘導(dǎo)軟骨分化過程的表達變化

3.1 TGF-β1刺激對鹿茸MSCs軟骨分化的影響 TGF-β1蛋白主要通過影響其信號通路下游基因Smad 4/Smad 3蛋白復(fù)合物來誘導(dǎo)干細胞軟骨分化。TGF-β1蛋白促使該復(fù)合物表達加強，刺激細胞基質(zhì)分泌，Smad3通過在COL2A1增強子區(qū)域與軟骨分化調(diào)控因子SRY-related

gene 9（SOX9）形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，誘導(dǎo)軟骨分化的開始，誘導(dǎo)軟骨的表面標(biāo)志collagen II蛋白的表達[12-15]。

表1 引物序列

結(jié)合前期對軟骨分化過程細胞形態(tài)變化[11]和本實驗軟骨表面標(biāo)志物及COLⅡ基因的表達結(jié)果，在外源TGFβ1刺激誘導(dǎo)下，鹿茸MSCs軟骨分化開始于第7天，第21天鹿茸MSCs已經(jīng)大量分化成軟骨細胞；第14天觀察到鈣的結(jié)晶體說明軟骨骨化也開始，誘導(dǎo)至第28天軟骨開始大量鈣化，啟動骨的形成。這一實驗結(jié)果一方面證實鹿茸軟骨是由MSCs分化而來，另一方面也很好地模擬了鹿茸自然生長過程軟骨內(nèi)成骨的過程。

3.2 在鹿茸MSCs軟骨分化過程TGF-β1對Wnt信號的影響 Wnt家族生長因子對哺乳動物很多方面的發(fā)育有重要的調(diào)控作用。Garriock等[16]對完整的老鼠和人類的基因組序列進行組裝，再加上表達序列標(biāo)簽的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了哺乳動物19種Wnt家族基因。

人的Wnt3A與Wnt3蛋白幾乎同源[17]，De Boer等[18]研究了氯化鋰與Wnt3A基因?qū)MSC成骨分化及成脂分化的影響，認為Wnt3A基因低表達水平促進hMSC及成骨細胞的增殖，而高水平表達促進堿性磷酸鹽形成，發(fā)動骨的形成和發(fā)育。Wnt3被發(fā)現(xiàn)與fz1形成的嵌合體是一種誘導(dǎo)C3H10T1/2細胞向成骨細胞分化的有效的激活劑[19]。而軟骨分化研究結(jié)果，認為Wnt3A能夠阻止MSCs軟骨分化，并通過抑制SOX9基因的表達引起關(guān)節(jié)軟骨去分化[20]。從本實驗鹿茸MSCs在TGFβ1刺激誘導(dǎo)下向軟骨及骨組織分化過程中，第21天即軟骨發(fā)育的關(guān)鍵時期Wnt3基因呈高表達特征，而在軟骨骨化過程Wnt3顯著下調(diào)表達，Wnt3對鹿茸軟骨內(nèi)成骨的調(diào)控結(jié)果與前人的結(jié)果不同，其作用機制有待繼續(xù)研究。

Yu等[21]通過轉(zhuǎn)基因過表達Wnt4，發(fā)現(xiàn)Wnt4能夠減少骨質(zhì)疏松和骨丟失，抑制骨骼衰老，并認為Wnt4小鼠模型通過抑制核因子-κB（NF-κB）通過非經(jīng)典Wnt信號調(diào)控骨組織生成。鹿茸MSCs軟骨分化及骨化過程Wnt4一直表現(xiàn)為上調(diào)表達，與Yu, B等對成骨發(fā)育研究結(jié)果相似。

Andrade等[22]比較了小鼠的長骨生長過程中軟骨成骨模式Wnt信號家族19個基因的表達變化，認為在軟骨進入分化與成熟前增殖階段，Wnt5A和Wnt5B表達量逐漸增加，而當(dāng)軟骨經(jīng)歷向肥大成熟及終末分化時，Wnt5B基因等表達下降。同時認為Wnt5B是經(jīng)由非經(jīng)典的Wnt信號通路—Wnt/Ca+2通路影響這一過程。Church等[23]分析了雞四肢骨發(fā)育過程Wnt家族生長因子的表達，發(fā)現(xiàn)Wnt5A僅僅關(guān)節(jié)組織和軟骨膜中表達，Wnt4在發(fā)育中的關(guān)節(jié)、一些骨組織和肥大的軟骨組織中表達，最終認為Wnt5A和Wnt5B促進體外早期軟骨發(fā)生，抑制終末分化，而Wnt4具有相反的作用。Yang等[24]也證實了Wnt5A和Wnt5B聯(lián)合調(diào)節(jié)軟骨細胞的增殖和分化。

本實驗中檢測到Wnt5A在鹿茸軟骨內(nèi)成骨過程的表達特征與Yang等的結(jié)果一致，但沒有檢測到Wnt5B的調(diào)控信號。

4 結(jié) 論

在TGF-β1刺激誘導(dǎo)下，塔里木馬鹿茸MSCs在體外可以分化成軟骨，進而成熟向骨細胞分化，實現(xiàn)鹿茸軟骨內(nèi)成骨模式；在該過程中Wnt家族生長因子（Wnt3、Wnt4、Wnt5A）和DKK1基因在軟骨發(fā)育期均上調(diào)表達，初步推斷在鹿茸軟骨發(fā)育過程DKK1對Wnt信號有阻抑作用；Wnt3、Wnt4、Wnt5A對軟骨分化與骨化有重要影響。在鹿茸軟骨內(nèi)成骨過程中，3個基因的調(diào)控功能與機制需要通過過表達或抑制表達實驗進一步研究。

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