俄木曲者，熊朝瑞*，范景勝，陳朝康，張錫文，聶忠源，孫 艷，劉世均，楊合琴

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066；2.四川富順縣農(nóng)牧業(yè)局，四川富順 643200；3.涼山州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，四川西昌 615000；4.四川省六順農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，四川富順 643200；5.金川縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，四川金川 624100）

先天性免疫系統(tǒng)作為初生幼體防御和抵抗外界致病病原體侵染的首要防線，其功能的正常發(fā)揮有利于提高山羊羔羊抗病力，增加出生后羔羊存活率。BCL10（B Cell Lymophoma-10）即B細(xì)胞淋巴瘤因子10，是機(jī)體內(nèi)一種重要的細(xì)胞免疫因子，在初生幼體先天性免疫系統(tǒng)中扮演重要角色[1-2]。最初，BCL10是Willis等[3-5]在研究3例帶有t（1:14）（p22, q32）轉(zhuǎn)位的低級MALT淋巴瘤患者時發(fā)現(xiàn)。BCL10基因位于染色體lp22，編碼約230個氨基酸分子，屬于胞內(nèi)蛋白，其N端存在一個Caspase募集結(jié)構(gòu)域（Caspase Reeruitment Domain，CARD），C端存在一個富含絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域[1-2,6]。該CARD由6個緊密壓縮的反平行的α-螺旋組成，類似于死亡結(jié)構(gòu)域（Death Domain，DD），與H型馬疙疹病毒E10基因的部分區(qū)域有高度的同源性，存在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用[3,7-8]。正常免疫反應(yīng)中，BCL10基因能通過編碼蛋白活化Caspase-9或者參與LPS/TLR4途徑激活NF-κB信號通路，促進(jìn)免疫系統(tǒng)中細(xì)胞成熟、凋亡以及免疫因子的產(chǎn)生，提高機(jī)體先天免疫能力，增強(qiáng)抵抗細(xì)菌類病原體感染的能力[9-10]。近年來，BCL10先天免疫調(diào)控研究在人[5,11]、家牛[12]、豬[13]及雞[14]中都有所報(bào)道，而在山羊上較少。本實(shí)驗(yàn)以NCBI中山羊BCL10基因預(yù)測序列為模板，通過同源比對、分子克隆等技術(shù)獲取BCL10基因序列，采用生物信息學(xué)預(yù)測序列功能，qRT-PCR方法構(gòu)建初生羔羊各免疫相關(guān)器官BCL10基因表達(dá)譜，最后構(gòu)建BCL10基因真核重組載體，為進(jìn)一步研究山羊BCL10基因功能及蛋白免疫機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為提高羔羊存活率提供產(chǎn)業(yè)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 對川南黑山羊肥羔型新品系初生羊羔（n=5）頸靜脈放血處死，采集肺臟、肝臟、頜下腺、脾臟、腎臟、胸腺和血液樣品，保存于液氮中備用。

1.1.2 菌株、載體及細(xì)胞來源 大腸桿菌DH5α和pEGFP-N1載體由本實(shí)驗(yàn)室提供；pMD1-T Simple購自上海生工生物技術(shù)有限公司；HEK293T細(xì)胞系由四川省畜牧科學(xué)研究院保存和提供。

1.1.3 主要試劑及儀器 RNAsimple Total RNA Kit、FastQuant RT Kit（天根生物技術(shù)有限公司），5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0試劑盒（Invitrogen公司）、SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit試 劑 盒（Clontech公司 ），Power SYBR?Green PCR Master Mix（Applied Biosystems? Cat: 4367659），T4連接酶、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI、Hind（TakaRa大連公司），質(zhì)粒提取試劑盒（BioDev公司），LipofiterTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（漢恒生物技術(shù)有限公司），胎牛血清、青鏈霉素雙抗（G418）、DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco公司），6孔和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar公司）。

凝膠成像系統(tǒng)（美國 BIO-RAD公司）、DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠）、CFX Connect? 熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（美國 BIO-RAD公司）、高速冷凍離心機(jī)（艾本德中國有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、搖床OLS200（Grant公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.1.4 軟件和網(wǎng)絡(luò)資源的利用 本研究中所用到的引物設(shè)計(jì)、生物信息學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)軟件見表1。

1.2 方法

1.2.1 山羊BCL10基因克隆 RNAsimple Total RNA Kit提取初生羔羊脾臟組織RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，核酸測定儀測定總RNA純度及濃度，260/280 nm處的OD比值在1.80～2.00為宜。FastQuant RT Kit反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。以GenBank中山羊BCL10基因預(yù)測序列（登錄號：XM_005678157.2）為模板，Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增BCL10基因cDNA中間區(qū)域引物（BCL10-F，BCL10-R）見表2。擴(kuò)增BCL10基因，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收PCR產(chǎn)物與pMD18T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。

表1 引物設(shè)計(jì)、生物信息學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)軟件

采用5'RACE System for Rapid Ampli fi cation of cDNA Ends Version 2.0試劑盒獲得BCL10基因的5'端序列，以前測序cDNA序列為模板，設(shè)計(jì)5'-UTR引物（表2）：A054-1（GSP1），A054-2（GSP2），A054-3（GSP3）。采用 SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得該基因的3'端序列，設(shè)計(jì)3'-UTR引物（表2）：3'649-1，3'649-2。按照試劑盒操作說明進(jìn)行BCL10基因5'端序列和3'端序列的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳純化，膠回收PCR產(chǎn)物與pMD18T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后對陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。

表2 山羊BCL10基因cDNA序列RACE擴(kuò)增引物序列信息

1.2.2BCL10基因序列生物信息學(xué)分析 根據(jù)材料1.1.4中生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)絡(luò)工具，對羔羊BCL10基因完整cDNA序列的氨基酸序列、蛋白質(zhì)二結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域、物種同源進(jìn)化樹分析，深入了解和預(yù)測BCL10基因的結(jié)構(gòu)和功能。

1.2.3BCL10基因組織表達(dá)譜分析 分別取5只系譜無親緣關(guān)系羔羊的肺臟、肝臟、頜下腺、脾臟、腎臟、胸腺及血液各30 mg左右，根據(jù)方法1.2.1提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。根據(jù)已克隆BCL10基因序列為模板，Primer 5.0設(shè) 計(jì) 引 物（ 表 3）：BCL10-f，BCL10-r，β-actin-f，β-actin-r。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：SsoAdvanced SYBR Green supermix 10 μL、Forward primer（10 μmol/L）0.5 μL、Reverse primer（10 μmol/L）0.5 μL、cDNA 1 μL、RNase-free water 8 μL；反應(yīng)體系：95℃熱變性3 min；95℃ 10 s；55℃ 20 s；72℃20 s，39 個 循 環(huán)，75℃延伸5 s。采用2-△△Ct法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并用SPSS18.0進(jìn)行組織間單因素方差法分析，P＜0.05表示組織間差異顯著。

1.2.4BCL10基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以完整BCL10基因序列為模板，PCR擴(kuò)增BCL10基因CDS全長，上游引物B1的5'端加上BamHⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物B2的5'端加上HindⅢ 酶切位點(diǎn)。PEGFP-N1載體經(jīng)BamHⅠ和PstⅠ雙酶切后，加入上述PCR產(chǎn)物，T4連接酶的作用下16℃連接過夜，連接入PEGFP-N1載體構(gòu)建重組質(zhì)粒PEGFP-N1-BCL10。然后將構(gòu)建好的PEGFP-N1-BCL10重組質(zhì)粒瓊脂糖凝膠檢測回收并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中篩選陽性克隆，PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

1.2.5 重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞 接種HEK293T細(xì)胞于24孔板中，每孔細(xì)胞濃度為2×105個/mL，加500 μL不含抗生素的10% FBS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；加入1 mL Opti-MEM洗細(xì)胞，重復(fù)1次，為細(xì)胞轉(zhuǎn)染做好準(zhǔn)備。以轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-BCL10作為實(shí)驗(yàn)組、PEGFP-N1作為陰性對照組、未轉(zhuǎn)染作為空白對照組，分別加入50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基預(yù)混合，再加入1 mL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋混勻；取2 μL Lipofectamine?ipofe 脂質(zhì)體與 50 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋混勻，室溫孵育5 min；將稀釋好的3個實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒與稀釋好的脂質(zhì)體混勻，室溫孵育20 min；將混勻的100 μL混合物小心加入到24孔板的細(xì)胞孔中，輕輕搖晃細(xì)胞板混勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染4～6 h后，將培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染72 h后，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

2 結(jié)果與分析

2.1BCL10基因克隆 獲得5只初生羔羊脾臟組織總RNA，質(zhì)量均較好（圖1）。選取濃度最高一份RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，PCR擴(kuò)增BCL10基因中段cDNA約為600 bp片段（圖2-A）。膠回收，構(gòu)建質(zhì)粒測序獲得BCL10基因中段cDNA區(qū)域包括620 bp。5'RACE和3'RACE由中段向兩端擴(kuò)增分別約為300 bp，構(gòu)建質(zhì)粒測序獲得BCL10基因5'、3'兩端序列各328 bp和322 bp（圖2-B和2-C）。3段序列組合拼接得到BCL10基因CDS區(qū)域全長693 pb，5'-UTR長度為161 pb，3'-UTR長度為169 bp，cDNA全長為1 023 bp。

圖1 羔羊脾臟總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2BCL10基因生物信息學(xué)分析

2.2.1BCL10基因一級結(jié)構(gòu)特征分析 初生羔羊BCL10基因共編碼230個氨基酸（圖3）。用Expasy在線軟件分析結(jié)果顯示山羊BCL10蛋白的分子量為25 995.3 ku，等電點(diǎn)是5.54，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為38，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為32。BCL10蛋白的分子式為C1129H1830N322O366S7，共由3 654個原子組成，不穩(wěn)定指數(shù)為64.15，表明BCL10蛋白是不穩(wěn)定蛋白，脂溶性指數(shù)為79.30，總的平均親水計(jì)算結(jié)果為-0.711。由于BCL10蛋白氨基酸末端N殘基為甲硫氨酸（Met）滿足“N端學(xué)說”，所以預(yù)測的BCL10蛋白半衰期，在體外哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞中為30 h，在酵母體內(nèi)大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10 h。

表3 山羊BCL10基因CDS擴(kuò)增及載體鑒定引物序列信息

圖2 羊BCL10基因cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 初生羔羊BCL10基因cDNA 的完整序列及其編碼蛋白的氨基酸序列

2.2.2BCL10基因二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 用NPS@在線預(yù)測BCL10蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖4），結(jié)果顯示氨基酸序列含39.13%的α螺旋（Alpha Helix），5.22%的延伸帶（Extended Strand），53.91%的隨機(jī)卷曲區(qū)域（Random Coil），1.74%的模糊區(qū)域（Ambiguous States）。

圖4 出生羔羊BCL10蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.3BCL10基因定位分析 用NCBI預(yù)測的BCL10蛋白序列保守區(qū)域（Conserved Domains）結(jié)果顯示，在17～100 aa左右存在CARD，類似于DD。利用TMHMM Server v.2.0分析BCL10蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果表明aa屬于跨膜區(qū)域機(jī)率為零，非跨膜蛋白或膜內(nèi)蛋白（圖5）。利用NetPhos軟件預(yù)測初生羔羊BCL10蛋白磷酸化位點(diǎn)結(jié)果，磷酸化電勢閾值為0～1，當(dāng)磷酸化電勢位于紅線上方即閾值＞0.5時，則該位點(diǎn)有可能被磷酸化（圖6）。山羊BCL10蛋白的230個氨基酸中，可能被磷酸化的位點(diǎn)一共有29個，包括絲氨酸（Ser）位點(diǎn)20個以及蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)9，其中絲氨酸接近磷酸電勢1的比例最大，這些絲氨酸位點(diǎn)被磷酸化的概率非常大，主要集中在50 aa和150 aa位置。蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山羊BCL10蛋白序列可能含有9個潛在的糖基化位點(diǎn)，分別是4、7、59、136、161、182、186、189、190 aa，當(dāng)閾值大于0.5時就可能被糖基化，其中161和189氨基酸糖基化的可能性最高，分別為0.628 9和0.627 6。WolFPSORT預(yù)測山羊BCL10蛋白細(xì)胞定位結(jié)果表明，在32個同源較近的蛋白中，細(xì)胞核定位值為8.5，細(xì)胞質(zhì)定位值18.5，細(xì)胞質(zhì)和核中都有的定位值為15，胞外定位值為3。說明BCL10蛋白極大可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。初生羔羊BCL10蛋白信號肽的預(yù)測結(jié)果顯示，剪切位置分值（C-score）、信號肽分值（S-score）和（Y-score）分值都小于基準(zhǔn)閾值0.5，所以山羊BCL10蛋白沒有信號肽（圖7）。

圖5 初生羔羊BCL10蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖6 初生羔羊BCL10蛋白磷酸化位點(diǎn)分布

圖7 初生羔羊BCL10蛋白信號肽預(yù)測

2.2.4BCL10基因進(jìn)化樹分析 用MEGA5.0對10種不同哺乳動物的BCL10蛋白做了進(jìn)一步同源分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山羊BCL10與水牛和綿羊的親緣關(guān)系最近（ 圖8）。水 牛（GenBank：XP_006080537.1）、 綿 羊（GenBank：XP_004002198.1）、家牛（GenBank：NP_001071496.1）、馬（GenBank：XP_001495228.2）、人（GenBank：NP_003912.1）、家兔（GenBank：XP_008263174.1）、野豬（GenBank：NP_001096683.1）、大鼠（GenBank：NP_112618.1）以及小鼠（GenBank：NP_033870.1）之間的同源性分別為53%、41%、100%、100%、39%、35%、99%。

2.3BCL10基因在山羊不同組織中的相對表達(dá)量 由圖9可知，BCL10基因mRNA在肺臟、肝臟、頜下腺、脾臟、腎臟、胸腺和血液中均有表達(dá)，其中頜下腺中表達(dá)最高，胸腺次之，其次為腎臟、脾臟、肺臟、肝臟、血液。頜下腺中BCL10基因表達(dá)量顯著高于肺臟、肝臟、脾臟、腎臟及血液（P＜0.05）；而與胸腺差異不顯著（P＞0.05）。胸腺中BCL10基因表達(dá)量顯著高于血液（P＜0.05）；與肺臟、肝臟、脾臟及腎臟中表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

圖8 不同物種BCL10基因進(jìn)化樹

圖9 BCL10基因在山羊不同組織中的表達(dá)

2.4 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-BCL10的鑒定 將構(gòu)建好的pEGFP-N1-BCL10轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒直接進(jìn)行測序鑒定，測序片段與克隆序列大小完全一致（圖10）。說明BCL10基因已經(jīng)成功插入pEGFP-N1表達(dá)載體中，且位置和讀碼框均正確。

2.5 重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞 利用熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BCL10質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞從12 h開始進(jìn)行隔天觀察，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染72 h后，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-BCL10實(shí)驗(yàn)組和pEGFP-N1陰性對照組均出現(xiàn)綠色熒光，未轉(zhuǎn)染空白對照組細(xì)胞無綠色熒光（圖11）。證明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞中并能夠正常表達(dá)。

3 討 論

圖10 真核重組質(zhì)粒pEGFP-N1-BCL10中BCL10 CDS凝膠電泳鑒定

圖11 pEGFP-N1-BCL10和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞72 h后顯微鏡白光和熒光檢測（200×）

BCL10基因是哺乳動物及鳥類免疫反應(yīng)中重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因。該基因高表達(dá)于淋巴細(xì)胞及邊緣區(qū)域的B細(xì)胞，參與黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展，能夠促進(jìn)細(xì)胞成熟、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等過程[4-5,15]。而此，該基因在機(jī)體各個器官中均有表達(dá)，且在骨髓、胸腺、脾臟等免疫器官中高表達(dá)并發(fā)揮重要的免疫作用[16]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，BCL10基因參與免疫系統(tǒng)行使免疫功能首先要通過自身磷酸化實(shí)現(xiàn)[8-9]，且只有全長轉(zhuǎn)錄條件下，才能活化Caspase-9或者介導(dǎo)LPS/TLR4途徑激活NF-κB信號通路[17]，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和成熟從而參與適應(yīng)性免疫和先天免疫反應(yīng)[18-19]。

3.1BCL10基因克隆與生物信息學(xué)分析 本研究通過初生羔羊脾臟組織中BCL10基因克隆，得到BCL10基因全長1 023 bp，其中CDS為693 bp，編碼230個氨基酸。通過生物信息分析發(fā)現(xiàn)，BCL10蛋白等電點(diǎn)為正，穩(wěn)定性較差，脂溶性較高，其預(yù)測結(jié)果對以后BCL10蛋白質(zhì)等電點(diǎn)鹽析及分離有重要作用。BCL10蛋白的半衰期預(yù)測對于后續(xù)的體外過表達(dá)、干擾等載體構(gòu)建及檢測時間實(shí)驗(yàn)提供了參考。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示BCL10蛋白沒有雙鏈β-螺旋，而存在α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。膜結(jié)合蛋白的純化結(jié)晶難度大，外源表達(dá)困難所以分析預(yù)測出BCL10屬于非膜結(jié)合蛋白，此對后續(xù)的BCL10基因的蛋白純化及過表達(dá)等研究具有重要的借鑒。糖基化預(yù)測和信號肽檢測發(fā)現(xiàn)，不存在信號肽序列，說明山羊BCL10蛋白不是分泌蛋白，其作用在于細(xì)胞內(nèi)，與已有的研究相似[1-2]。結(jié)合山羊BCL10生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，推斷山羊BCL10蛋白是一種在細(xì)胞質(zhì)中合成并停留在胞質(zhì)內(nèi)作用的非分泌、非膜結(jié)合、N端存在CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白。這一結(jié)果初步揭開BCL10基因的主要功能結(jié)構(gòu)域所編碼的蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，為進(jìn)一步闡明該基因在山羊免疫系統(tǒng)中扮演的重要角色提供了可靠的參考。同源進(jìn)化樹分析山羊BCL10蛋白與水牛和綿羊的親緣關(guān)系最為接近，無疑為山羊借鑒免疫生理現(xiàn)象找到了可靠的參考家畜類型。

3.2BCL10基因羔羊組織表達(dá)比較 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCL10基因在羔羊頜下腺表達(dá)最高，在其他文獻(xiàn)中尚未報(bào)道，羔羊出生后由于哺乳原因極大地刺激了唾液腺發(fā)育，其中可引起腺體細(xì)胞NF-κB信號通路激活，促進(jìn)細(xì)胞成熟和凋亡，而調(diào)控此通路的上游基因則有可能是BCL10基因[7,20]。此外，由于頜下腺除了含有大量腺細(xì)胞以外，還有部分淋巴細(xì)胞，頜下腺快速發(fā)育也能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，從而伴隨有BCL10基因高表達(dá)情況[21]。頜下腺位置與淋巴結(jié)靠近，可能具有淋巴結(jié)相似的免疫功能[5,22-23]，但需要進(jìn)一步證明。此外，胸腺中BCL10基因表達(dá)量較高，這與何建鋒等[13]在大白豬上發(fā)現(xiàn)BCL10基因組織表達(dá)譜研究結(jié)果基本一致，說明羔羊出生后，胸腺器官在先天免疫過程中起著重要的作用。脾臟、腎臟中的表達(dá)則與豬上表達(dá)情況有所出入，這可能是由于物種特異性造成的組織器官免疫功能強(qiáng)弱的差異，需要進(jìn)一步研究。血液中BCL10基因的表達(dá)量最低，這可能是由于BCL10基因主要調(diào)節(jié)和參與B細(xì)胞成熟和增殖[7,15,24]，從而起免疫應(yīng)答作用，而游離在血液中的免疫細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等白細(xì)胞，而非免疫B細(xì)胞，除非存在血管組織損傷，否則表達(dá)極少。

3.3 BCL10重組載體真核表達(dá)鑒定 本研究成功地將BCL10基因構(gòu)建到帶有綠色熒光標(biāo)記的真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，實(shí)現(xiàn)了BCL10蛋白的瞬時表達(dá)。由于山羊的pEGFP-N1-BCL10重組表達(dá)載體未見報(bào)道，該質(zhì)粒的重組為該蛋白的穩(wěn)定表達(dá)和單克隆抗體的制備與篩選提供了寶貴原始材料，對于后續(xù)研究基因功能和指導(dǎo)培育優(yōu)良抗病的山羊品系具有深遠(yuǎn)的意義。

4 結(jié) 論

本研究首次克隆了山羊BCL10基因序列，并對其生物信息學(xué)功能進(jìn)行了分析，檢測了其在免疫相關(guān)組織中的表達(dá)分布情況，構(gòu)建了表達(dá)重組載體。研究表明了BCL10在山羊中的基本情況，為進(jìn)一步探索山羊BCL10基因在免疫系統(tǒng)中的作用和功能提供參考價(jià)值，同時，對于今后培育優(yōu)良抗病山羊品種給予指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn):

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