屠云潔，束婧婷，蘇一軍，章 明，姬改革，劉一帆，巨曉軍，鄒劍敏

（江蘇省家禽科學研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇揚州 225125）

雞主要組織相容性復合體（Major Histocompatibi1ity Complex，簡稱MHC）位于16號染色體上，又稱為B復合體，共包括B-F、B-L和B-G 3個座位。B-F區(qū)相當于哺乳動物基因的I類抗原；B-L區(qū)對應于哺乳動物MHC基因的Ⅱ類抗原；B-G區(qū)編碼產(chǎn)物又稱Ⅳ類抗原[1-3]。MHC基因具有高度的多態(tài)性，且與生存環(huán)境密切相關[4-5]。相對野生動物，養(yǎng)殖條件下傳染病病原是家禽的主要威脅，MHC基因的多態(tài)性更多是主要病原體選擇的結果[6]。MHCⅡ類分子主要遞呈外源性抗原，而內源性抗原的遞呈則由MHCⅠ類分子負責。MHCⅠ類分子分布較廣泛，幾乎表達于所有有核細胞表面，但不同的組織細胞表達Ⅰ類抗原的密度各不相同[7]。雞MHCI基因有2個拷貝，稱為BF1和BF2，轉錄方向相反，BF2優(yōu)勢表達，基因組DNA全長約2 kb，由8個外顯子和7個內含子組成[8-10]。

狼山雞是我國古老的優(yōu)良地方品種，目前采用保種場和基因庫保種，國家級地方雞種基因庫（江蘇）于2000年引種進行異地保護，多年來一直采用家系等量隨機保種法繼代繁殖，至今已保存17個世代。為監(jiān)測狼山雞保種效果，通過Illumina平臺Miseq重測序方法分析0（G0）、5（G5）、10（G10）、12（G12）、14（G14）、15（G15）、17（G17）世代的MHCBF1和BF2基因座多態(tài)性，以揭示狼山雞不同世代間MHCBF1和BF2基因序列變異，為更好地監(jiān)測保種效果提供科學的決策依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 狼山雞保種群 G0、G5、G10、G12、G14、G15、G17（每個世代20個樣品），隨機從江蘇省家禽科學研究所基因庫保存的狼山雞血樣中隨機抽取。實驗用Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL2000 Markerk均購自上海生物工程有限公司。

1.2 總DNA提取 DNA 提取按照分子克隆的方法[11]。

1.3 雞MHCBF1和BF2基因全序列多態(tài)性分析Illumina平臺測序，DNA文庫建立，Miseq測序和統(tǒng)計分析，使用多重PCR方法構建DNA文庫，擴增子大小為300～400 bp。不同的樣品通過不同的引物區(qū)分（引物序列見表1），并對擴增子進行高通量測序。使用Illumina MiSeq測序平臺進行測序，測序模式配對結束，測序讀取長度為2×300 bp。序列數(shù)據(jù)是通過使用Cutadapt軟件去除連接器序列得到（DOI http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200）。序列比對軟件BWA（v0.7.12）用于比較切割后參照序列的MHCBF1和BF2序列。Genesis Analysis Toolkit（GATK）軟件用于突變檢測(http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices)。

1.4 統(tǒng)計分析 根據(jù)每個樣本的等位基因基因型，獲得基因的等位基因數(shù)、等位基因頻率（Pi）、平均觀察雜合度（Ho），平均期望雜合度（He）和多態(tài)性信息含量（PIC）。Ho=觀察得到雜和個體數(shù)/樣本個體數(shù)總數(shù)。He根據(jù)Nei）[12]提供的公式計算：

其中，pi是第i個等位形式的頻率，n是等位形式的數(shù)目。

PIC根據(jù)Bostein等[13]的公式計算：

其中，Pi和Pj分別為第i個和第j個等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。

使用SPSS 16.0比較狼山雞保種群G0、G5、G10、G12、G14、G15、G17世代的平均 He、Ho和PIC。P＜0.05為差異顯著水平。

2 結果與分析

應用重測序的方法得到狼山雞G0、G5、G10、G12、G14、G15、G17MHCBF1（2768bp）、BF2（2204 bp）的全長序列。在狼山雞7個世代中分別鑒定出MHC BF1、BF2基因59和34個SNPs。如表2所示，狼山雞MHCBF1基因 Ho、He、PIC在 G10、G12、G14保持穩(wěn)定，Ho在不同世代變化情況為G17＞G15＞G14、G12、G10 ＞G5＞G0，He 和 PIC 在不同世代變化情況為 G17、G15＞G14、G12、G10＞G5＞G0（P＜0.05），MHCBF2基因的Ho在G10、G14、G15保持穩(wěn)定，其他世 代 變 化情況為 G17、 G12 ＞G15、G14、G10＞G0、G5（P＜0.05）；He 和 PIC 在 G12、G14、G15和G17，保持穩(wěn)定，在其他世代變化情況為G17、G15、G14、G12＞G10＞G5、G0（P＜0.05）。

表1 狼山雞MHC BF1和BF2引物序列

表2 不同世代MHC BF1基因Ho、He和PIC

表3 不同世代MHC BF2基因Ho、He和PIC

3 討 論

MHC進化機制主要是病原體選擇機制，MHC多態(tài)性能夠反映動物種群生活史的適應性進化和生存能力。MHC基因的變異可反映基因組水平的變異，通過MHC基因的變異分析，可有效地評估品種遺傳多樣性的水平。因此，MHC基因被認為是群體遺傳學和保護遺傳學研究中最新的基因系統(tǒng)[14]。

雜合度又稱遺傳多樣性，是反映被測基因座位的遺傳變異，通常被認為是衡量群體遺傳多樣性較適合的遺傳參數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，狼山雞MHCBF1基因He范圍是0.23～0.47，G0最低，G0～G17群體遺傳多樣性逐漸升高，G15和G17最高，雜合度與PIC結果一致。隨著世代的增加，MHCBF1和BF2基因的純合度下降，遺傳多樣性增加，其中G0遺傳多樣性最低，可能是因為狼山雞G0時親緣關系程度較高，狼山雞保種群于2000年組建，此后，避免全同胞和半同胞交配，雜合度和PIC從G5到G17逐漸增加，MHCBF1基因遺傳多態(tài)性的增加，也為MHC基因適應不斷變化的抗原創(chuàng)造了條件，MHC基因多態(tài)性是其編碼的蛋白質參與抗原呈遞的重要的分子基礎[15-16]。G10、G12和G14基本保持穩(wěn)定，這可能是因為狼山雞保種群逐步適應當?shù)氐沫h(huán)境，抗病性比較好，也反映G10、G12、G14狼山雞免疫系統(tǒng)對外來寄生物（細菌、病毒、寄生蟲等）識別和反應比較穩(wěn)定。MHCI類（MHCBF1，BF2）分子識別并結合內源性肽段（主要來自于細胞胞漿內的病原微生物，如病毒或細菌等），負責外源抗原的識別和表達MHC基因的變異水平，MHCBF基因不斷直接影響個體對病原體疾病的抵抗，對不斷變化的外界環(huán)境的適應能力起著關鍵作用[17]。

狼山雞MHCBF基因不同世代遺傳多樣性的變化符合波動選擇（時空變換的選擇）假說，病原體的種類波動變化造成了對種群個體選擇密度的變化，從而維持了群體中MHC的多樣性[18]，隨著時間的推移和空間的變換，病原體的種類與多樣性跟著變化，相應地，宿主對病原菌和寄生蟲等易感性也會變化。病原體抗原的空間多樣性會直接導致在不同地區(qū)產(chǎn)生不同的選擇壓力[19]。倘若在種群間存在有限基因交流或者存在空間交流阻礙，MHC多態(tài)性會導致種群對當?shù)靥赜械牟≡⑸锶后w的適應性。狼山雞保種群一直被保存在國家級地方雞種基因庫，不存在空間交流情況，這也可能是由于隨著時間的推移，保種群逐步適應當?shù)夭≡⑸锶?，保種群MHC BF基因遺傳多樣性基本保持穩(wěn)定。

4 結 論

狼山雞不同世代MHCBF1和BF2遺傳多樣性變化規(guī)律不太一致，但總體規(guī)律符合波動選擇（時空變換的選擇）假說，隨著時間的推移MHCBF基因遺傳多樣性變得更為豐富，在某些連續(xù)幾個世代群體遺傳多樣性基本保持穩(wěn)定，這可能與MHCBF基因功能有關。

參考文獻:

[1] Chausse A, Coudert M F, Dambrine G,et al. Molecular genotyping of four chicken B complex haplotypes wit B-L bata B-F and B-G probs[J]. Immunogenetics, 1989, 29(1): 129-130.

[2] 屠云潔, 蘇一軍, 張學余, 等. 幾個雞種MHC B-G座位克隆與生物信息學分析[J]. 中國畜牧雜志, 2012, 48(15):8-11.

[3] 屠云潔, 蘇一軍, 張學余, 等. 9個地方雞種MHC B-G座位多態(tài)性及其分子系統(tǒng)進化分析[J].安徽大學學報, 2012,36(2):88-94.

[4] Kubinak J L, Ruff J S, Hyzer CW,et al. Experimental viral evolution to specific host MHC genotypes reveals fitness and virulence trade-offs in alternative MHC types[J]. Proc Natl Acad Sci, 2012,109(9): 3422-3427.

[5] McCairns R J, Bourget S, Bernatchez L. Putative causes and consequences of MHC variation within and between locally adapted stickleback dem[J]. Mol Ecol, 2011, 20(3):486-502.

[6] Zhang M, He H X. Parasite-mediated selection of major histocompatibility complex variability in wild brandt’s voles(L asiopodomysbrandtii)from Inner Mongolia, China[J]. BMC EvolBiol, 2013,13:149.

[7] Antoniou A N, Powis S J, Elliott T. Assembly and export of MHC class I peptide ligands[J]. Curr OpinI mmunol, 2003,15(1):75-81.

[8] 戴銀 , 胡曉苗 , 趙瑞宏 , 等 . 雞 M HC Ⅰα和β2 m 鏈基因真核表達載體的構建及其在293T 細胞中的表達[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2016, 43(8): 1938-1943.

[9] 武永淑, 韓凌霞. 家禽MHC結構研究進展[J]. 遺傳, 2012,34(6):673-678.

[10] Frangoulis B, Park I, Guillemot F,et al. Auffary, R. Zoorob.Identification of thetapasin gene in the chicken major histocompabibilitycomplex[J]. Immunogenetics, 1999, 49 (4):328-337.

[11] 薩姆布魯克. 分子克隆實驗指南[M]. 第2版. 沈陽: 遼寧科學技術出版社, 1992.

[12] Nei M. Estimation of average heterozygosity and geneticdistance from a small number of individuals[J]. Gene, 1978,89:583-590.

[13] Botstein D, White R L, Skolnick M,et al. Const-ruction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Am J Hun Genet, 1980, 32:314-331.

[14] Hedrick P W. Perspective: highly variable loci and their interpretation in evolution andconservation[J]. Evolution, 1999,53: 313-318.

[15] Bematchez L, Landry C. MHC studies in nonmode vertebrates:what have we learned about natural selection in 15 years[J]. J Evol Biol, 2003, 16(3): 363-377.

[16] Barber L D, Parham P. Peptide binding to major histocompatibil itycomplemolecules[J]. Ann Revcell Biol, 1993, 9(1): 163-206.

[17] EshelI, Hamilton W D. Parent offspring correlation in fimess under fluctuating selection[J]. P Roy Soc B-BiolLSci, 1984,222(1226):1-14.

[18] Lively C M, Jokelaf J. Temporal and spatial distributions of parasites and sex in a freshwater snail[J]. Evol Ecol Res,2002, 4(2):219-226.

[19] Bonneaud C, Pérez-Tris J, Federici P,et al. Major histocompatibility alleles associatedwith local resistance to realaria in a passerine[J]. Evolution, 2006, 60(2):383-389.