張家燕，王曉娜，李金晶，黃小圓，朱春芳，費前進，葛紅山，4*

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1.第二臨床醫(yī)學(xué)院，2.附屬第二醫(yī)院，3.附屬第一醫(yī)院，溫州 325000；4.江蘇泰州人民醫(yī)院，泰州 225300)

在全球范圍內(nèi)，約有15%的夫婦面臨著不孕不育的困擾，其中男性因素占了50 %[1-2]。男性不育最常見的病因是以精子活力低下為主要表現(xiàn)的精子功能缺陷[3]。精子活力主要取決于精子鞭毛的運動，而鞭毛運動的能量供應(yīng)主要由線粒體氧化磷酸化或糖酵解提供[4]。線粒體在胞內(nèi)ATP的生產(chǎn)和鈣離子平衡的維持中起到重要的作用，該過程也是精子線粒體內(nèi)活性氧(mROS)的主要來源[5]。線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷會導(dǎo)致線粒體膜電位的改變，且過量的mROS會導(dǎo)致精子的氧化損傷，引起精子活力下降，最終導(dǎo)致男性不育[6]。因此線粒體穩(wěn)態(tài)的維持對精子活力至關(guān)重要。

線粒體lon蛋白水解酶(又稱LonP1)，是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的重要蛋白之一，位于線粒體基質(zhì)內(nèi)，由核基因編碼，具有蛋白水解酶活性、伴侶分子功能和維持線粒體DNA(mtDNA)穩(wěn)定作用的ATP依賴的絲氨酸肽酶[7]。過往研究證實，LonP1的表達與人類腫瘤[8]、衰老[9]、神經(jīng)退行性病變[10]、心血管疾病[11]密切相關(guān)。LonP1通過降解氧化損傷的蛋白及失去功能的線粒體，避免氧化修飾的和具有蛋白毒性的大分子蛋白在細胞內(nèi)聚集，使細胞保持年輕態(tài)[2]。

那么作為調(diào)控精子活力和功能的關(guān)鍵器官，人類精子線粒體中是否存在LonP1蛋白的表達？LonP1蛋白與精子活力是否存在相關(guān)聯(lián)系？ 本研究旨在確定LonP1是否存在于精子中、該蛋白的定位，以及探究LonP1對精子線粒體穩(wěn)態(tài)的維持調(diào)節(jié)作用及其可能存在的調(diào)節(jié)機制。

資料與方法

一、研究對象

選擇2016年6月至2017年6月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院男科實驗室進行精液常規(guī)檢查的標本120 份。

入選標準：禁欲2～7 d；精子濃度>20×106/ml；有2 次以上精子質(zhì)量檢測報告；患者年齡25～45 歲。

排除標準：不符合上述入選標準者；合并嚴重內(nèi)外科疾病，可能影響研究結(jié)果；以及不能配合研究者。

本研究遵循的程序符合溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會所制定的倫理學(xué)標準，得到該委員會批準，分組征得受試對象本人的知情同意，并與之簽署臨床研究知情同意書。

二、主要試劑/儀器

硅膠顆?；鞈乙?Percoll)(Solarbio，中國)；輸卵管液培養(yǎng)液(HTF)(Quinn，美國)；2-氰基-3，12-二氧代齊墩果烷-1，9(11)-二烯-28-酸甲酯(CDDO-ME)(Sigma，美國)；二甲基亞砜(DMSO)(Solarbi，中國)；LonP1抗體(Abcam，英國)；β-actin抗體(Bioworld，美國)；兔二抗(Biosharp，中國)；MitoSOX Red(Life，美國)；線粒體膜電位檢測試劑盒(Beyotime，中國)；其他化學(xué)試劑均購于中國浩豐生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：熒光顯微鏡(Olympus FluoView FV500，德國)；電泳儀(Biorad，美國)；多功能酶標儀(Bioteck，美國)；流式細胞儀(BD，美國)。

三、實驗方法

1. 精液采集：男方禁欲2～7 d，通過手淫法將精液采集到無菌潔凈的一次性取精杯中，靜置于37℃恒溫箱中液化30 min，待完全液化后進行檢測和處理。

2. 分組及處理方法：精液分析經(jīng)連續(xù)3 次以上的指標提示精子向前運動(PR)<50 %或A級運動的精子<25%，而精子密度及其它參數(shù)指標正常或基本正常者，診斷為弱精子癥。因此根據(jù)PR差異，我們將精液標本分為正?；盍?NS)組(48例)和弱精子癥精子(AS)組(42例)。繼而分別檢測精子運動參數(shù)、LonP1蛋白含量、mROS含量和精子的線粒體膜電位強度(MMP)。

根據(jù)CDDO-ME作用濃度，將密度梯度離心處理后的NS組(30例)精液標本分為正?？瞻讓φ战M和CDDO-ME處理組，CDDO-ME處理組分別用2種濃度梯度的CDDO-ME(2.5 μmol/L和5 μmol/L)處理2 h，之后收集樣本分別檢測精子運動參數(shù)、LonP1蛋白含量、mROS含量和MMP。

3. 精液梯度離心： 精液處理前首先配制80%和40%的Percoll溶液。采用密度梯度離心法處理精液標本，取1 ml 80%Percoll加入到一支15 ml離心管底部，再加入1 ml 40% Percoll，后加入2 ml液化的精液到已配制的分離層上，然后1 500 r/min離心15 min，棄上清液。將試管底部約0.3 ml液體轉(zhuǎn)移至裝有4 ml HTF的小離心管內(nèi)，混勻，再以1 500 r/min離心10 min，棄上清液，留試管底部沉淀用HTF重懸。

4. CDDO-ME處理：將CDDO-ME粉末用DMSO配制成濃度為50 mmol/L的儲存液備用。將洗滌后的精液分為兩組：空白對照組(CDDO-ME濃度為0 μmol/L)和CDDO-ME處理組。參考CDDO-ME處理對其他細胞LonP1功能抑制的作用濃度[12]，CDDO-ME處理組的2組培養(yǎng)液分別加入不同體積的CDDO-ME儲存液，使其CDDO-ME作用終濃度分別為2.5 μmol/L和5 μmol/L。空白對照組和處理組的精液同時放入6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于第2 h收集樣本進行檢測。

5. 精子運動參數(shù)檢測：采用計算機輔助精液分析系統(tǒng)(CASA) 分析精液精子密度、精子活力(PR)、活率(PR+NP)、平均路徑速度(VAP)、直線速度(VSL)、曲線速度(VCL)、直線性(LIN)、前向性(STR)和精子頭部側(cè)向擺動幅度(ALH)等。

6. 免疫熒光蛋白定位：精子經(jīng)PBS洗滌后做精子涂片，后經(jīng)4 %多聚甲醛固定20 min，后在PBS中潤洗10 min，重復(fù)3次。0.1 % Triton打孔10 min，含10 %牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，后室溫下抗LonP1抗體孵育4 h，PBS潤洗后HRP兔二抗避光孵育30 min；陰性對照用PBS代替一抗，步驟同前。攝片用共聚焦顯微鏡獲得。

7. 蛋白免疫印跡：精子樣本經(jīng)離心和PBS洗滌2次后，加入100 μl SDS裂解液裂解30 min，4℃溫度下17 000 r/min 離心10 min，取上清。蛋白上樣量為40 μg，經(jīng)10 %SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜(Millipore，美國)。室溫下于5 %脫脂牛奶中封閉2 h，隨后分別加LonP1一抗和β-actin一抗4℃搖床過夜。TBST漂洗三次，每次10 min，后室溫下HRP兔二抗室溫下?lián)u床孵育2 h，經(jīng)TBST洗滌后曝光?；瘜W(xué)發(fā)光信號通過Super Signal West Pico(Pierce，美國)獲得，結(jié)果通過Quantity One software(AlphaEaseFC，美國)分析。

8. 精子的線粒體膜電位(MMP)檢測：精子線粒體膜電位檢測采用5，5’，6，6’-四氯-1，1’，3，3’-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物(JC-1)熒光染料法進行。膜電位高時JC-1形成聚合物于線粒體基質(zhì)發(fā)紅色熒光，膜電位低時形成單體發(fā)綠色熒光，因此綠色熒光/紅色熒光比值越大代表膜電位越低，反之亦然。密度梯度離心法處理后的精子用培養(yǎng)液稀釋為(1～2)×106個/ml，陽性對照CCCP(10 μmol/L)預(yù)處理20 min，后經(jīng)JC-1工作液(1 mmol/L)37℃孵育30 min，然后4℃下用PBS離心洗滌3 次，加入1 ml JC-1緩沖液重懸，經(jīng)流式細胞儀獲取數(shù)據(jù)，每組計數(shù)10 000個精子，MMP通過綠色熒光強度和紅色熒光強度的比值來表示。

9. 精子線粒體內(nèi)活性氧(mROS)檢測：精子線粒體活性氧檢測采用線粒體超氧化物紅色熒光探針熒光染料法進行。密度梯度離心法處理后的精子用培養(yǎng)液稀釋為(1～2)×106個/ml，隨后經(jīng)10 μmol/L Mitosox Red 37℃下避光孵育10 min，其中陰性對照不作處理，然后PBS洗滌3 次，重懸后通過流式細胞儀計數(shù)10 000個精子，PE通道下計算平均熒光密度(MFI)，計算得到mROS水平。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、LonP1在精子中表達定位

通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，LonP1穩(wěn)定表達于精子中段的線粒體鞘部，且NS組相較AS組，LonP1的熒光強度更強(圖1)。

二、NS組和AS組精子中LonP1蛋白水平的表達差異

根據(jù)精子前向運動水平的高低，我們將精子分為了NS組和AS組，并對其進行了蛋白免疫印跡分析。結(jié)果顯示，LonP1在約106 KDa位置處，有單一條帶(圖2A)，蛋白定量分析顯示NS組LonP1表達顯著高于AS組(P<0.05)(圖2B)。

NS組精子中LonP1熒光圖(A1)和原圖(A2)；AS組精子中LonP1熒光圖(B1)和原圖(B2)圖1 兩組精子中LonP1的熒光表達(×40)

A：LonP1蛋白免疫印跡圖譜；B：精子LonP1蛋白的相對定量；與NS組比較，*P<0.05圖2 兩組精子中LonP1的蛋白免疫印跡圖和定量分析

三、精子LonP1表達與精子活力、精子MMP水平及mROS含量的關(guān)聯(lián)性

通過比較NS組與AS組精子活力(圖3A)、線粒體功能相關(guān)指標(圖3B、C)，發(fā)現(xiàn)MMP水平相較AS組，NS組顯著增高，mROS水平則明顯降低，且均具有顯著性差異(P<0.05)，表明LonP1表達水平越高，MMP越高，mROS含量越低，兩兩存在一定關(guān)聯(lián)性(表1)。

初到西點軍校的時候，我只有22歲，是系里最年輕的講師。當時二戰(zhàn)已經(jīng)結(jié)束，我覺得人生就像一場剛開始的盛宴。

A：精子活力的差異；B：mROS的差異以及mROS檢測的流式圖；C：MMP的差異以及MMP檢測的流式圖；與NS組比較，*P<0.05，**P<0.01 圖3 兩組精子活力差異和線粒體穩(wěn)態(tài)的差異

組別PR(%)LonP1MMP(%)mROS(MFI)NS組69.89±8.100.52±0.094.72±4.05418.85±139.61AS組26.10±13.48#0.22±0.01*12.73±10.23*460.52±123.35*

注：與NS組比較，*P<0.05，#P<0.01

四、CDDO-ME對精子LonP1功能的抑制作用

Gibellini等[12]利用2-氰基-3，12-二氧代齊墩果烷-1，9(11)-二烯-28-酸甲酯(CDDO-ME)這種抗癌分子抑制了人類癌細胞中線粒體蛋白LonP1的功能，故本研究中分別設(shè)置了0 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L濃度梯度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)2 h CDDO-ME體外培養(yǎng)后，CDDO-ME處理組LonP1表達水平較正?？瞻讓φ战M顯著下降(P<0.05)(圖4A、4B)。

五、LonP1功能抑制對精子線粒體穩(wěn)態(tài)的影響

經(jīng)CDDO-ME作用后，隨著LonP1蛋白表達水平降低，JC-1綠色熒光/紅色熒光比值增加，即MMP逐步降低(圖5A)，mROS水平增加。與空白對照組比較，5 μmol/L濃度處理組有顯著改變(P<0.05)(圖5B、表2)。

A：CDDO-ME處理后LonP1蛋白免疫印跡圖譜；B：CDDO-ME處理后LonP1蛋白表達的相對定量；與空白對照組比較，*P<0.05 圖4 LonP1功能抑制劑CDDO-ME處理后LonP1蛋白表達的變化

組別LonP1表達MMP(%)mROS(MFI值)空白對照組(0μmol/L)3.73±0.827.34±3.79462.26±126.842.5μmol/L組3.05±0.69*25.47±23.81537.61±183.865μmol/L組2.98±0.69*78.81±28.11*640.68±226.58*

注：與空白對照組比較，*P<0.05

六、LonP1功能抑制對精子活力的影響

經(jīng)LonP1功能抑制劑CDDO-ME 0 μmol//L、2.5 μmol/L和5 μmol/L進行2 h的體外培養(yǎng)，與空白對照組(0 μmol//L)相比，其余兩組的PR+NP無顯著性變化(P>0.05)，而VAP、VSL隨濃度升高有顯著下降(P<0.05)；5 μmol/L組的PR、VCL、ALH、LIN及STR均顯著性下降(P<0.05)(表3)。

討 論

LonP1在維持線粒體穩(wěn)態(tài)和細胞代謝方面的重要作用已被大量研究證實。在過去20年里，在不同的實驗?zāi)Ｐ椭械玫降慕Y(jié)果證明，LonP1在調(diào)節(jié)線粒體活動中具有重要作用，作為多功能酶去移除錯誤折疊和氧化修飾的蛋白；在蛋白質(zhì)毒性，缺氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時支持細胞存活；以及維護和調(diào)節(jié)mtDNA的代謝[13-14]。LonP1蛋白具有很多功能，包括水解酶作用[15]，伴侶分子作用[16]，線粒體DNA結(jié)合蛋白作用[17]。下調(diào)LonP1能夠?qū)€粒體呼吸，mtDNA質(zhì)量和數(shù)量產(chǎn)生重大影響，且最終影響細胞代謝[18-19]。

A：驗證CDDO-ME處理后線粒體膜電位的變化；B：CDDO-ME處理后mROS的變化；與空白對照組比較，*P<0.05 圖5 LonP1功能抑制劑CDDO-ME處理后線粒體穩(wěn)態(tài)的變化

目前為止尚未有研究提出LonP1在精子線粒體中的表達，而我們實驗發(fā)現(xiàn)，在精子線粒體鞘部存在LonP1蛋白的熒光表達，且LonP1在NS組精子中表達明顯高于AS組。NS組精子線粒體功能明顯優(yōu)于AS組精子線粒體功能的發(fā)現(xiàn)，恰恰反映了LonP1蛋白與精子線粒體功能和穩(wěn)態(tài)的維持存在重要聯(lián)系。有大量研究證實，弱精子癥患者的精子線粒體膜電位顯著低于正常人的精子線粒體膜電位，線粒體ROS水平也要明顯高于正常人[20]。線粒體膜電位是反映線粒體內(nèi)產(chǎn)生能量的三羧酸循環(huán)狀況的重要指標，膜電位降低將導(dǎo)致線粒體能量的供給障礙，使得精子的鞭毛運動沒有足夠的ATP支持，從而精子活力受到影響[21]。而Kumar等[22]提出氧化應(yīng)激損傷與精子活力密切相關(guān)。精子內(nèi)適當水平的ROS能夠調(diào)節(jié)其高活躍性運動，獲能及頂體反應(yīng)，過量的ROS會使線粒體內(nèi)膜出現(xiàn)非特異的通透性轉(zhuǎn)運孔道，使線粒體膜電位降低，導(dǎo)致精子活力下降[20]。因此精子線粒體膜電位和線粒體ROS水平均與精子活力密切相關(guān)。我們在前期的預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，弱精子癥病人的精液標本經(jīng)后續(xù)藥物處理后，由于其本身線粒體膜電位較低及線粒體ROS水平過高的原因，精子的供能和氧化損傷均受到打擊，在經(jīng)過LonP1功能抑制劑處理后，精子線粒體穩(wěn)態(tài)進一步削弱，弱精子癥病人的精子存活時間更無法比擬正?；盍?。因此為了長時間的觀察后續(xù)的LonP1功能抑制效應(yīng)，我們采用了正常組精液標本并通過密度梯度離心法得到活力更優(yōu)的精子作為實驗對象。

表3 不同濃度CDDO-ME處理2 h后精子運動參數(shù)比較(-±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

Berstein等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在敲除LonP1在淋巴瘤細胞中的表達以及Granta細胞經(jīng)CDDO抑制LonP1功能后，均可在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)線粒體形態(tài)的缺失以及高密度電子包涵體在線粒體基質(zhì)中聚集。Rawe等[24]研究表明活力低下的精子常并發(fā)精子尾部線粒體鞘數(shù)量減少及結(jié)構(gòu)異常。所以我們推測，LonP1蛋白作為定位于線粒體，具備調(diào)節(jié)線粒體功能的重要多功能蛋白，其表達水平可能與精子線粒體形態(tài)完整性和線粒體數(shù)目有關(guān)。弱精子癥病人的精子電鏡發(fā)現(xiàn)其精子線粒體形態(tài)的缺失和線粒體數(shù)目較為明顯的下降[25]，更加合理解釋了NS精子中LonP1蛋白表達高于AS組的現(xiàn)象。由此我們推測，LonP1表達水平越高，精子線粒體功能越穩(wěn)定。

線粒體作為精子運動的主要供能器官，通過氧化磷酸化合成ATP，與精子活力息息相關(guān)[24]。那么是否LonP1表達水平越高，精子活力就越優(yōu)呢？我們對NS組和AS組精子中LonP1表達水平及線粒體功能指標進行了關(guān)聯(lián)性分析，并發(fā)現(xiàn)LonP1的表達水平與精子活力，精子線粒體膜電位及線粒體ROS水平均存在密切的關(guān)聯(lián)，其中LonP1表達水平與精子活力和線粒體膜電位正相關(guān)，與線粒體ROS水平呈負相關(guān)。而CDDO-ME處理抑制LonP1功能抑制后發(fā)現(xiàn)精子運動參數(shù)和線粒體膜電位均存在不同程度的下降，線粒體ROS也有一定程度的增加。以上與我們前期的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果相符，進一步證明LonP1參與調(diào)節(jié)了線粒體穩(wěn)態(tài)，LonP1表達水平越高，精子線粒體穩(wěn)態(tài)越穩(wěn)定。

2-氰基-3，12-二氧代齊墩果烷-1，9(11)-二烯-28-酸甲酯(CDDO-ME)是一種LonP1特異性抑制劑[23]。多項研究發(fā)現(xiàn)，對RKO人直腸癌細胞系進行CDDO-ME處理24 h后，LonP1表達下降，并伴隨著線粒體功能的變化[12，23]。而我們實驗發(fā)現(xiàn)，CDDO-ME處理濃度為2.5 μmol/L并體外培養(yǎng)2 h后，相較空白對照組，藥物處理組精子活力變化無明顯差異，而此時LonP1表達已受到顯著抑制，而在后期第24 h的精子活力檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)2.5 μmol/L濃度組的精子活力下降要明顯高于空白對照組，下降約47.20 %，而精子活率僅下降8.90 %。以上均表明，精子活力是在LonP1功能受到抑制后才出現(xiàn)下降，而并非CDDO-ME本身的藥物毒性影響。Gur等[26]的研究指出，線粒體核糖體參與了精子獲能過程中的蛋白轉(zhuǎn)運，而精子中核編碼mRNA能夠被轉(zhuǎn)運至精子線粒體核糖體，該過程還受到精子活力、獲能及頂體反應(yīng)的影響，這也就解釋了為什么LonP1的蛋白表達水平能夠被CDDO-ME調(diào)節(jié)。我們實驗利用CDDO-ME特異性抑制精子線粒體內(nèi)LonP1的功能，并通過蛋白免疫印跡驗證LonP1抑制效果，并發(fā)現(xiàn)LonP1功能抑制后，對比空白對照組，除精子PR+NP無明顯變化，大部分精子運動參數(shù)均有不同程度的下降，精子的線粒體穩(wěn)態(tài)也發(fā)生了負面的改變，其中包括了線粒體ROS增加和膜電位的下降。

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