馬 倩，馬寶月，穆 波，馬 慧

（沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，沈陽 110161）

啟動子在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中占有核心地位，決定基因的表達水平，是位于基因的上游、能夠活化RNA聚合酶的一段DNA序列。在高等植物中，基因的表達調(diào)控過程主要有DNA水平、染色體水平、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控和翻譯后調(diào)控，在這六大調(diào)控方式中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控方式是最為主要的，它主要受順勢作用原件與轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)調(diào)作用。而在啟動子區(qū)域，有很多能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控過程中具有重要作用順勢作用原件，其通過驅(qū)動下游基因的表達來增加植物對非生物脅迫的抵抗能力。所以，對啟動子進行克隆，并仔細分析其序列功能對具有重要作用的功能原件和調(diào)控區(qū)域進行精準的定位。有利于研究基因的調(diào)控機制及轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，并且應(yīng)用于基因工程從而進行植物遺傳改良。

1 克隆啟動子的幾種常用方法

1.1 常規(guī)的PCR技術(shù)克隆啟動子

利用常規(guī)PCR方法，根據(jù)已知的啟動子序列來設(shè)計擴增全長序列的引物，由于該方法操作簡便并且快捷，所以，近年來被廣泛的應(yīng)用在克隆序列已知的基因啟動子中，但是此方法不能用來克隆未知的啟動子序列。

自從1985年P(guān)CR技術(shù)誕生以來，通過PCR技術(shù)來克隆基因啟動子便成為了最常見的一種方法。Tao等（2014）根據(jù)已發(fā)表的玉米ZmRXO1基因的啟動子序列設(shè)計引物，以玉米的基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)擴增反應(yīng)得到1576 bp的ZmRXO1基因的啟動子。蘇寧等（2003）以已經(jīng)發(fā)表的水稻中葉綠體的16S rRNA基因的啟動子堿基序列為理論依據(jù)進行引物的設(shè)計，以水稻的葉綠體DNA為模板，利用PCR技術(shù)進行擴增反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)擴增出的序列與已知的啟動子序列同源性高達100%。由此可見，利用常規(guī)PCR方法克隆已知序列的啟動子，操作簡單、便捷，準確度高。但缺點在于不能克隆新的啟動子。

1.2 反向PCR

反向PCR（I-PCR，Inverse PCR）是Triglia等（1998）最早提出的在PCR基礎(chǔ)上改進的染色體步移的技術(shù)。其原理如圖1所示：首先使用合適的限制性內(nèi)切酶將植物的基因組DNA進行酶切反應(yīng)，然后利用T4連接酶將DNA片段自連，使其形成環(huán)狀的DNA，然后再以環(huán)化的DNA作為反應(yīng)模板，根據(jù)已知序列來設(shè)計反向引物，通過PCR擴增反應(yīng)來獲得未知片段。韓志勇等（2001）利用I-PCR技術(shù)，以轉(zhuǎn)基因水稻為試驗材料，通過克隆技術(shù)獲得了外源基因的側(cè)翼序列，并且在一周時間內(nèi)，通過克隆獲得的35個水稻轉(zhuǎn)基因株系長度大約在300～750 bp的外源基因的側(cè)翼序列。張曉等（2012）采用I-PCR和TAIL-PCR方法從棉花中克隆到了線粒體atpA雙拷貝基因的側(cè)翼序列。該方法高效、快速、穩(wěn)定、簡單便捷，引物設(shè)計方便，但是PCR擴增過程容易形成非特異性產(chǎn)物，效率比較低。

1.3 接頭PCR

接頭PCR技術(shù)是一種對植物的基因組DNA已知的序列兩側(cè)未知序列進行擴增的技術(shù)，是繼反向PCR技術(shù)之后的又一種克隆啟動子的方法，可以用來對已知的基因序列上游啟動子的序列進行PCR擴增。其原理為：設(shè)計一個長鏈接頭和一個與長鏈5’端互補的短鏈接頭，需要在短鏈接頭3’端添加一個NH2，以防止聚合酶在促反應(yīng)時短鏈進行延伸，再用幾種合適的限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行酶切反應(yīng)，然后利用T4連接酶把酶切后得到的DNA片段與合成的接頭引物相連接，以連接后的產(chǎn)物作為PCR擴增反應(yīng)的模板，以接頭特異性引物（與接頭序列互補）和基因特異性引物（與已知基因5’端序列互補）作為上下游引物進行兩輪的巢式PCR擴增。

圖1 I-PCR原理Triglia等（1998）

圖2 LA-PCR試劑盒流程圖Li等（2005）

Xin等（2012）首先利用限制性內(nèi)切酶對橡樹的基因組DNA進行酶切，然后經(jīng)過兩輪的巢式PCR擴增反應(yīng)后，成功的獲得了6個蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因、1個海藻糖合酶基因和1個海藻糖轉(zhuǎn)化酶基因。根據(jù)接頭PCR技術(shù)的反應(yīng)原理，寶生物公司推出了LA-PCRTMin vitro Cloning Kit，其用來對基因側(cè)翼的未知序列進行擴增反應(yīng)，原理如圖2所示。Li等（2005）利用該試劑盒在山葡萄中進行擴增，獲得了幾丁質(zhì)酶基因VCH3上游的1216 bp啟動子序列。該方法操作簡單便捷，但是擴增產(chǎn)物特異性較差，擴增產(chǎn)物需要進一步雜交驗證。

1.4 熱不對稱交錯PCR

熱不對稱交錯PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）是由Liu等（1995）最早提出的，該方法以基因組DNA為模板，由已知目的基因的5’端序列，設(shè)計了3個嵌套引物（sp1，sp2，sp3，20 bp左右）和Tm值較低的隨機簡并引物（AD，14 bp左右）組合，進行3輪PCR反應(yīng)擴增特異性產(chǎn)物，能夠高效快速地擴增未知序列，試驗流程如圖3所示。Li等（2007）結(jié)合了接頭PCR技術(shù)和TAIL-PCR技術(shù)兩種擴增方法，以遼寧堿蓬的基因組DNA為模板，克隆獲得了SlCMO基因上游的2204 bp的啟動子序列。陳軍營等（2007）以小麥為試驗材料，采用TAIL-PCR方法進行克隆，得到了位于GLP3基因上游的1748 bp處的啟動子的堿基序列。利用TAIL-PCR方法進行克隆，克隆前不需要對基因組DNA模板進行酶切，其優(yōu)點在于能夠避免產(chǎn)生環(huán)化和連接、擴增的產(chǎn)物特異性強、擴增效率高、靈敏度高，已經(jīng)在分子生物學克隆未知序列的研究中被廣泛應(yīng)用，但是使用該方法需要較高純度的模板DNA和引物，擴增條件也比較嚴格。

圖3 Genome Walking Kit的實驗流程圖Liu等（1995）

1.5 融合引物巢式PCR

融合引物與巢式聚合酶鏈式反應(yīng)（fusion primer and nested integrated PCR，F(xiàn)PNI-PCR），是一種在TAIL-PCR方法原理的基礎(chǔ)上改進的PCR技術(shù)（Wang et al. 2011）。在隨機通用引物的5’端連接上接頭序列，使第二輪、第三輪的PCR變成了普通PCR，節(jié)省了實驗時間。根據(jù)已知基因5’端序列來設(shè)計3個特異性的嵌套引物，并與9個特殊設(shè)計的隨機簡并引物（AD）混合物相配合，進行第一輪的巢式PCR基于隨機通用引物去設(shè)計兩個具有特異性的引物來代替AD，進行第二和第三輪的常規(guī)PCR，第二和第三輪的FPNI-PCR是以上一輪的PCR擴增產(chǎn)物稀釋25或50倍為模板，再進行PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物，試驗流程如圖4所示。Zhang等（2013）采用FPNI-PCR方法，在日本落葉松中克隆到了LaTCTP基因的上游的啟動子序列，利用軟件分析結(jié)果顯示在體細胞胚胎發(fā)育過程中存在很多起調(diào)控作用的順式作用元件。李婧等（2016）利用FPNI-PCR技術(shù)進行克隆，在大花三色堇中獲得了花青素合成酶（VwANS）基因的上游啟動子序列，并對實驗反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，實驗結(jié)果表明模板的稀釋倍數(shù)是根據(jù)簡并引物的不同而進行調(diào)整，才能擴增到清晰地條帶。FPNI-PCR技術(shù)克隆已知基因的側(cè)翼序列可以有效的降低非特異性擴增，具有快捷方便、穩(wěn)定性好、靈敏性高的獲得目的序列的優(yōu)點，是擴增未知片段的有效技術(shù)。

2 誘導型啟動子的功能研究

啟動子本身并不能直接參與基因活動，而是需要通過與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合才能發(fā)揮其作用。

控制基因表達的時間和表達程度。所以，啟動子的功能主要由啟動子中與轉(zhuǎn)錄因子集合的元件決定。目前，在高等植物誘導型啟動子功能的分析與研究中，常用的方法主要包括生物信息學、瞬時表達分析、點突變、穩(wěn)定表達分析、酵母單雜技術(shù)、凝膠阻滯分析（EMSA）、DNase Ⅰ足跡分析等（Behnam et al. 2013），以及近些年應(yīng)用的RNAi技術(shù)等。

2.1 生物信息學分析

圖4 FPNI-PCR實驗流程圖Wang 等（2011）

利用生物信息學軟件對克隆獲得的啟動子序列進行元件的預(yù)測與分析，為今后的啟動子功能研究提供了依據(jù)，同時也促進了啟動子的研究效率（Hehl et al. 2001）。目前，能夠?qū)幼拥墓δ茉M行預(yù)測和分析的常用的數(shù)據(jù)庫及分析軟件有：

2.1.1 Promoter Scan（http：//www.bimas.dcrt.nih.gov.molbio/proscan）轉(zhuǎn)錄調(diào)控的數(shù)據(jù)庫（Prestridge 1995）

其主要功能是進行啟動子預(yù)測。已經(jīng)開發(fā)了計算機程序PROMOTER SCAN，以識別Pol II啟動子序列的百分比，同時僅允許較小的誤報率。PROMOTER SCAN目前是最好的三個程序識別靈長類啟動子序列，PROMOTER SCAN能夠識別大部分新穎性的提案啟動子序列，同時保持低的假陽性率。

2.1.2 PLACE（plant cis-acting regulatory DNA elements http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE）植物DNA順式調(diào)控元件的數(shù)據(jù)庫（Higo et al.1999）

PLACE能夠總結(jié)所查數(shù)據(jù)的當前地位及可利用的工具。PLACE數(shù)據(jù)庫中每個基序的文檔包含每個基序的簡要定義和描述，以及可用的PubMed ID號和GeneBank登錄號的相關(guān)文獻。用戶可以使用網(wǎng)站上的SingalScan程序的順式作用原件查詢序列。結(jié)果將以三種形式之一報告。

2.1.3 Promoter 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Promoter）順式作用元件的數(shù)據(jù)庫（Knudsen 1999）

Promoter2.0目前已經(jīng)被開發(fā)為和啟動子區(qū)域中的序列相互作用的模擬轉(zhuǎn)錄因子的進化。它建立在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法常用的原則上。

2.1.4 PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）植物順式調(diào)控元件（Rombauts et al.1999）

PlantCARE是植物順式調(diào)控元件，增強子和阻遏物的數(shù)據(jù)庫。除了在序列上發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄基序之外，它還提供了包含完整基因序列的EMBL條目的鏈接以及基序變成功能的條件的描述。

2.1.5 TRANSFAC（transcriptional regulation from patterns to profiles http：//www.gene-regulation.com）轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)據(jù)庫（Matys et al. 2003）

提供實驗確定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和位置權(quán)重矩陣的最全面的收集。包含轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)，靶基因和調(diào)控結(jié)合位點的TRANSFAC數(shù)據(jù)庫已被擴展和進一步開發(fā)，無論是條目數(shù)量以及收集的數(shù)據(jù)的范圍和結(jié)構(gòu)。表達模式的結(jié)構(gòu)域已被引入人類和小鼠的轉(zhuǎn)錄因子，使用CYTOMER數(shù)據(jù)庫在解剖結(jié)構(gòu)和發(fā)育階段。

2.1.6 PlantPAN（http：//plantpan2.itps.ncku.edu.tw）用于檢測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的數(shù)據(jù)庫（Chow et al. 2016）

植物啟動子分析導航器為檢測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（TFBS），相應(yīng)的TF和其他重要的調(diào)控元件（CpG島和串聯(lián)重復(fù)序列）在植物中的啟動子或一組啟動子中。目前的PlantPAN版本（2.0版）在76種植物中含有16 960個TF和1 143個TF結(jié)合位點的基因。

2.2 點突變

點突變分析可以精確定位核心調(diào)控元件的位置，可通過轉(zhuǎn)座子插入突變，或用限制性內(nèi)切酶酶切特定的功能元件，然后再將插入的突變片段或者啟動子的缺失片段轉(zhuǎn)入到植物中確定的特定原件。此方法是在研究啟動子的功能元件中經(jīng)常用到的方法，利用該方法分析獲得的元件主要有TATA-box和CAAT-box。（Khuranan et al. 2013）。

2.3 瞬時表達分析

瞬時表達分析主要是將啟動子連接到報告基因的上游，然后轉(zhuǎn)化到模式植物中，從而使報告基因能夠在短時間內(nèi)得到表達，而外源基因則不需要整合到植物的基因組中，而是在脅迫條件下，通過對報告基因表達量的檢測來分析啟動子的活性，（Logemanm et al. 2013；Lu et al. 2013），瞬時表達只能進行定性分析，而不能用作對啟動子誘導活性的檢測，是對啟動子是否具備啟動功能進行驗證的常用方法。

2.4 穩(wěn)定表達分析

穩(wěn)定表達分析的原理是將缺失表達片段與將啟動子序列去除的表達載體序列連接構(gòu)建缺失表達載體，然后通過基因槍法、農(nóng)桿菌介導法等方法轉(zhuǎn)化模式植物，進而獲得能夠穩(wěn)定表達的植株。然后對穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因植株進行脅迫處理，對報告基因的表達量進行檢測。根據(jù)對報告基因表達量的分析，來判斷啟動子的誘導活性和組織特異性的調(diào)控元件（Esfandiari et al. 2013）。通過構(gòu)建不同缺失片段表達載體轉(zhuǎn)化植物，可以根據(jù)報告基因表達量的高低精確地確定順式作用元件的具體位置和作用功能（Alzohairy et al. 2013；Creux et al. 2013）。穩(wěn)定表達分析是對啟動子的功能研究中最為常用的一種分析方法，能夠確定啟動子的不同區(qū)段作用元件的功能，能夠準確地定量分析報告基因的表達量，實驗結(jié)果可靠，但是獲得穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因材料的周期長。

2.5 酵母單雜技術(shù)

酵母單雜交技術(shù)（yeast one-hybrid）最初是由Li等在酵母雙雜技術(shù)的基礎(chǔ)上改進的，根據(jù)報告基因的表型來分析啟動子區(qū)域作用元件與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用的一項技術(shù)。由于酵母單雜交技術(shù)檢測特定的轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件特異性的相互作用的敏感性和可靠性，已被廣泛的用于克隆細胞中含量低的、采用生化純化手段難以純化的轉(zhuǎn)錄因子（文添龍等，2014）。

2.6 凝膠組織分析

凝膠阻滯分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一種能夠簡單并且快速地檢測出蛋白質(zhì)與特異性DNA序列間結(jié)合情況的技術(shù)，可以用來對啟動子和特定轉(zhuǎn)錄因子之間結(jié)合情況的檢測，從而能夠確定出啟動子的區(qū)域核心作用元件。其作用原理：在凝膠電泳過程中，由于電場正負極的作用，小分子DNA片段向陽極移動的速度比結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA片段的速度更快，因此，根據(jù)條帶遷移率的快慢程度就能夠判斷出DNA分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。凝膠阻滯分析也是研究啟動子的區(qū)域功能元件和轉(zhuǎn)錄因子之間結(jié)合情況的一種重要手段，進而確定出新的作用元件?；蛘哂脕眚炞C已知作用元件與轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合情況。

2.7 DNaseⅠ足跡分析

DNase Ⅰ足跡分析法（DNase footprinting）也是用于研究順式作用元件與蛋白質(zhì)相互作用的一種方法，該方法能夠精確地確定與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段長度及序列（Galas et al. 1978）。其基本原理是用DNase I部分消化已進行單鏈末端標記的待測雙鏈DNA，在變性聚丙烯酰胺凝膠上形成以相差一個核苷酸為梯度的DNA條帶；當DNA片段與其蛋白質(zhì)特異性結(jié)合后，結(jié)合蛋白的區(qū)域?qū)艿降鞍椎谋Ｗo，避免受到DNase I的攻擊，因此形成切割梯中的空白區(qū)域，再經(jīng)過DNA化學測序法，就可預(yù)測到該結(jié)合區(qū)的堿基序列。

3 結(jié)語與展望

在植物基因的表達過程中，調(diào)控基因表達的途徑有很多，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控起著非常重要的作用。在轉(zhuǎn)錄水平上，由于啟動子區(qū)域的順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子之間相結(jié)合，共同參與調(diào)控功能基因的表達。因此對于誘導型啟動子來說，在克隆和功能分析的研究越來越受到廣泛的關(guān)注。目前對誘導型啟動的研究技術(shù)初期階段，將脅迫誘導型啟動子通過基因工程的手段轉(zhuǎn)入植物，增強植物的抗逆性，但其分子機制卻不清楚。在本文中，簡要的介紹了克隆啟動子的幾種常用的方法以及功能分析的方法，隨著分子生物學技術(shù)的逐步發(fā)展，將會出現(xiàn)更多的克隆啟動子的方法和應(yīng)用于啟動子順式作用元件分析的技術(shù)，將會發(fā)現(xiàn)越來越多的功能元件和轉(zhuǎn)錄因子，從而提高植物的基因調(diào)控過程水平的能力。對了解基因的表達調(diào)控模式奠定基礎(chǔ)，為提高轉(zhuǎn)基因植物的表達效率提供重要的依據(jù)。

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