陳巧梅, 柳 青, 申 琳, 薛 蕓, 王 彥, 閻 超(上海交通大學藥學院, 上海 200240)

隨著生命科學、食品安全和環(huán)境保護等各個領(lǐng)域的快速發(fā)展,迫切需要建立具有高分辨率、高靈敏度、高分離速度等特性的分析平臺。加壓毛細管電色譜(pressurized capillary electrochromatography, pCEC)結(jié)合了毛細管電泳(CE)和HPLC雙重分離機理,采用電滲流和壓力流共同推動流動相,不受柱內(nèi)反壓的限制[1],可以應用比UPLC更小粒徑的填料,實現(xiàn)更高的分離柱效。此外,電滲流所帶來的柱塞型前鋒也能夠大大減少色譜分離過程中的峰展寬,進一步提高柱效[2]。因此,將亞微米材料和pCEC技術(shù)相結(jié)合可提供一個新的分析平臺。

根據(jù)范式方程,色譜填料分布均勻有助于降低由色譜柱內(nèi)部路徑不一造成的峰展寬。單分散性二氧化硅微球由于形狀均一、尺寸可控、表面易功能化等特點,在色譜填料中具有極大的應用價值。St?ber等[3]最先利用氨水催化正硅酸乙酯的物理化學方法合成硅顆粒,該方法由于具有原料廉價、工藝簡單、產(chǎn)物單分散性良好等特點,應用廣泛[4]。

三唑類手性農(nóng)藥是目前廣泛應用的一種植物調(diào)節(jié)劑與殺菌劑,其對映異構(gòu)體在生物體內(nèi)的活性、毒理作用以及代謝等方面的差異性引起了社會的廣泛關(guān)注[5]。例如烯唑醇(diniconazole)和烯效唑(uniconazole)的S體表現(xiàn)出植物調(diào)節(jié)劑的作用,而R型則表現(xiàn)出較強的殺菌活性[6]。動物實驗表明,三唑類手性農(nóng)藥對大鼠的肝臟毒性不同,且已被美國環(huán)境保護署列為潛在人類手性致癌物[7,8]。目前,手性農(nóng)藥的拆分方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[9-16]和毛細管電色譜法(CEC)[17-19]。Wang等[10]使用自制的支鏈淀粉-三(苯基氨基甲酸酯)色譜柱在HPLC正相色譜模式下于31 min內(nèi)實現(xiàn)了烯唑醇的分離,分離度為2.05。Li等[15]利用Pirkle型Chirex 3020在HPLC模式下將烯效唑、烯唑醇和丙環(huán)唑(propiconazole)分別進行單獨拆分,實現(xiàn)了基線分離,但未實現(xiàn)3種農(nóng)藥的同時拆分和分離。Wan等[17]采用膠束電動毛細管色譜法同時分離3種手性三唑類農(nóng)藥(包含烯唑醇),結(jié)果顯示僅添加單一的環(huán)糊精(CD)無法將3種對映體同時分離,最終在27 mmol/L 羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)和3 mmol/L HP-γ-CD二元系統(tǒng)條件下實現(xiàn)了3種手性農(nóng)藥的同時拆分和分離,分離度大于1.1,分離時間為22 min。迄今,還未見有對烯效唑、烯唑醇以及丙環(huán)唑等3種手性三唑類農(nóng)藥同時拆分和分離的報道。

本實驗室曾對St?ber法進行改進,合成了亞微米級別的色譜介質(zhì)[20],但合成時間較長,效率不高。本研究在此基礎上,通過優(yōu)化實驗條件,在2 h內(nèi)高效制備出了粒徑為420 nm、單分散性良好的亞微米二氧化硅微球,經(jīng)C18修飾并填裝制備成亞微米反相毛細管色譜填充柱。本文將小粒徑色譜填料與pCEC技術(shù)相結(jié)合,利用C18固定相的反相作用機理和手性添加劑手性選擇機理,在12 min內(nèi)成功實現(xiàn)了3種手性農(nóng)藥烯效唑、烯唑醇和丙環(huán)唑的同時拆分和分離,為手性三唑類農(nóng)藥的同時拆分和分離提供一個新的思路和方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TriSepTM-3000加壓毛細管電色譜儀(Unimicro Technologies Inc., 美國); SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司); KQ5200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(河南鞏義市予華儀器有限責任公司); DM36-12馬弗爐(上海德恭實業(yè)有限公司); XW-80A漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠); TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠); JD200-3電子天平(鄭州南北儀器有限公司); Molcell 1805V摩爾細胞型純水機(重慶摩爾水處理設備有限公司); S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM,日本電子株式會社);Zeta-Sizer ZS-90激光粒度分析儀(英國Malvern儀器有限公司);ASAP2020 M比表面積孔隙度及化學吸附分析儀(Micromeritics Inc.,美國);Vario EL Cube元素分析儀(德國Elementar公司)。

羥丙基-γ-環(huán)糊精(HP-γ-CD)、十八烷基三氯硅烷、甲基三氯硅烷購自上海阿拉丁試劑有限公司;無水乙醇、氨水、甲苯、正硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS)、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉購自國藥集團化學試劑公司;丙酮購自上海凌峰化學試劑有限公司;乙腈(色譜純)購自Tedia公司;烯效唑(批號C1608078,純度97.5%)、烯唑醇(批號20150303,純度98.8%)和丙環(huán)唑(批號K1608036,純度97%)均購自上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1亞微米二氧化硅微球的制備及C18修飾

亞微米二氧化硅微球的合成:根據(jù)文獻[3,20,21]提供的方法,經(jīng)過進一步改良,合成粒徑為420 nm的亞微米SiO2微球:取15 mL 28%的濃氨水、24.75 mL超純水以及一定量無水乙醇混合液,倒入150 mL圓底燒瓶內(nèi)于油浴鍋中25 ℃控溫磁力攪拌混合均勻。配制7 mL正硅酸四乙酯和一定量無水乙醇至50 mL燒杯中,超聲混勻。將混合液快速倒入圓底燒瓶中,高速攪拌后,降低攪拌速度,于25 ℃下反應2 h。反應結(jié)束后,用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性,加入超純水多次浮選,至上層超純水沒有明顯的懸浮顆粒。依次用超純水和無水乙醇洗滌3次,經(jīng)220 nm濾膜抽濾后,轉(zhuǎn)移至坩堝中,于65 ℃烘箱中干燥,于馬弗爐中煅燒,備用。

亞微米二氧化硅微球的C18修飾:稱取經(jīng)硝酸活化的SiO2微球1 g,轉(zhuǎn)移至50 mL干燥的圓底燒瓶中,加入無水甲苯25 mL,超聲1.5 h。加入0.2 mL無水吡啶,2 mL十八烷基三氯硅烷,常溫下磁力攪拌12 h。反應結(jié)束后,依次用甲苯、無水乙醇、丙酮洗滌,65 ℃真空干燥。取經(jīng)C18修飾的SiO2微球1 g,以1 mL甲基三氯硅烷代替上述十八烷基三氯硅烷,重復上述C18修飾方法,對微球進行封尾。

1.2.2毛細管色譜柱的制備及pCEC分析條件

毛細管色譜柱的裝填:截取內(nèi)徑為100 μm的毛細管50 cm,將C18微球分散液吸入毛細管中,勻漿法填充,燒結(jié)柱塞和窗口備用。

色譜柱:自制C18毛細管色譜柱(10 cm×100 μm, 420 nm);定量環(huán):1 μL;分流比約為2 200∶1;施加電壓:-9.4 kV,進口端接地,負極施加于毛細管柱出口端;流動相:乙腈-20 mmol/L磷酸緩沖液(pH=6.8,含20 mmol/L HP-γ-CD)(45∶55, v/v);流速:0.04 mL/min;檢測波長:220 nm。

1.2.3樣品制備

精密稱取烯效唑、烯唑醇和丙環(huán)唑?qū)φ掌愤m量,用甲醇配制成2.5 g/L的儲備液,用0.22 μm微孔濾膜過濾,置于4 ℃冰箱中備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞微米二氧化硅微球的制備和表征

2.1.1亞微米二氧化硅微球合成條件的優(yōu)化

參考St?ber法[3],經(jīng)過改良,以大量的乙醇作為溶劑,用氨水作為反應的催化劑,以正硅酸乙酯為硅源,經(jīng)過水解縮聚生成二氧化硅微球。優(yōu)化條件下合成的二氧化硅微球,其掃描電鏡圖(SEM)見圖1a,該條件下合成的微球粒徑均勻,表面光滑,單分散性良好。

圖 1 二氧化硅微球的掃描電鏡圖Fig. 1 Scanning electron microscope (SEM) images of the SiO2 particles a. 420 nm particles; b. particles with conglutination; c. cross-section of 420 nm C18 column after using for 300 times.

實驗中分別考察了氨水濃度、TEOS濃度對微球的影響。其中,氨水濃度和TEOS濃度對微球粒徑單分散性的影響顯著(見表1)。反應液1～3反映了TEOS濃度對微球粒徑的影響,隨著TEOS濃度的增加,二氧化硅微球粒徑顯著增加。反應液4～6為氨水濃度對微球粒徑的影響,隨著氨水濃度的增加,微球粒徑逐漸增大。但是,隨著氨水濃度和TEOS濃度的增大,微球的單分散性減弱,當TEOS或氨水濃度過大時,出現(xiàn)了微球粘連共生情況(見圖1b)。猜測是因為TEOS和氨水濃度增加提高了水解反應的速度,生成的三維網(wǎng)絡鏈交織聚合在一起,聚合度增大,使微球傾向于團聚,粒徑分布變寬。本實驗還考察了水濃度對微球的影響,水濃度為13 ～22 mol/L時,微球粒徑變化不顯著。故本工作的合成條件最終確定為:TEOS濃度為0.31 mol/L,氨水濃度為2.20 mol/L,超純水濃度為13.74 mol/L,反應時間為2 h。該方法反應時間短,且所合成的微球粒徑非常均勻,單分散性好。

為了進一步考察該合成方法的重現(xiàn)性,在表1中Number 2條件下分批次合成二氧化硅微球,共合成了6批,通過SEM測得其粒徑大小,計算得到不同批次間的相對標準偏差為4.2%,說明該方法的重現(xiàn)性良好。

表 1 TEOS濃度與氨水濃度對微球粒徑的影響Table 1 Effects of TEOS and NH4OH concentration on particle size

TEOS: tetraethyl orthosilicate.

2.1.2亞微米二氧化硅微球的表征

為了進一步表征二氧化硅微球的單分散性,采用激光粒度分析儀檢測微球的粒徑分布。結(jié)果(圖2)顯示平均粒徑為421.1 nm, PDI (particle dispersion index)為0.002,本條件下制備的PDI值明顯小于0.05,說明微球是均勻的單分散體系。

圖 2 二氧化硅微球的激光粒度分析儀檢測圖Fig. 2 Laser particle analyzer images of the SiO2 particles

圖 3 SiO2微球的(a)N2吸附-解吸附圖和(b)孔徑分布圖Fig. 3 (a) N2 adsorption-desorption isotherm plot and (b) pore size distribution curve of the SiO2 particles

所制備亞微米二氧化硅微球的氮氣吸附-解吸附曲線和孔徑分布圖見圖3?？梢钥闯?其氮氣吸附-解吸附曲線中滯后環(huán)吸附曲線和脫附曲線分離處的相對壓力極低,說明毛細孔的孔徑很小,而曲線均屬于IV型吸附平衡等溫線,說明這是微球堆積成的介孔結(jié)構(gòu)[22]。由孔徑分布圖可以看出,孔徑集中分布在1 nm以內(nèi)。實驗最終測得該二氧化硅微球的比表面積、孔徑和總孔容積為13.538 m2/g、0.891 nm和0.019 cm3/g。

該二氧化硅微球為無孔結(jié)構(gòu),相比于常規(guī)全多孔微球填料具有更好的機械性能。圖1c為使用約300次、柱壓為12～18 MPa時420 nm微球毛細管柱橫截面的電鏡表征圖,可以看出,亞微米無孔二氧化硅微球填充柱在長時間使用后,顆粒堆積均勻,形態(tài)規(guī)整,沒有出現(xiàn)明顯的破損情況。因此,在較高的壓力條件下,無孔二氧化硅微球的抗壓能力強,機械性能好,具有良好的長期穩(wěn)定性和較長的使用壽命。

采用元素分析法,測定了所制備二氧化硅微球的C含量,結(jié)果為1.62%,說明C18成功修飾在二氧化硅微球表面。

2.1.3亞微米毛細管色譜柱的重現(xiàn)性考察

色譜柱的重現(xiàn)性對手性分離效果極為重要。為了考察所制備色譜柱的重現(xiàn)性,在相同pCEC條件下,以二苯甲酮作為標記物,比較了柱間(N=3)和批間(N=3)色譜柱的重現(xiàn)性,其保留時間的相對標準偏差依次為1.99%和2.03%;以烯效唑作為柱內(nèi)重現(xiàn)性考察標記物,重復進樣8次,烯效唑?qū)τ丑w保留時間的相對標準偏差依次為1.00%和1.01%,峰面積的相對標準偏差依次為2.38%和2.55%。由此可見,本文所制備的亞微米毛細管色譜柱在pCEC模式下具有良好的重現(xiàn)性。

2.2 三唑類手性農(nóng)藥分離度的影響因素考察

2.2.1流動相中手性添加劑濃度對分離度的影響

考察了流動相中手性添加劑濃度對3種對映體分離度的影響(見圖4)?？梢钥闯?隨著HP-γ-CD濃度的增加,烯效唑和烯唑醇對映體的分離度呈現(xiàn)上升趨勢,在HP-γ-CD濃度為20 mmol/L時分離度達到最佳,說明隨著手性添加劑濃度的增加,溶質(zhì)分子與環(huán)糊精包合作用增強,分離度增加;再繼續(xù)增加環(huán)糊精濃度,分離度降低,可能是因為體系黏度增大,影響了分離效果。丙環(huán)唑?qū)τ丑w的分離度隨環(huán)糊精濃度變化不明顯,在10 mmol/L時分離度達到最大,但僅能達到基本分離,可能是因為HP-γ-CD對丙環(huán)唑的包合作用較弱。

圖 4 羥丙基-γ-環(huán)糊精的濃度對3種對映體分離度的影響Fig. 4 Effects of HP-γ-CD concentration on resolution of the three enantiomers Column dimension: 10 cm (effective length)×100 μm; mobile phase: ACN-20 mmol/L phosphate buffer (pH=7.8) containing HP-γ-CD (40∶60, v/v); UV detection wavelength: 220 nm; pump flow rate: 0.035 mL/min.

2.2.2乙腈體積分數(shù)對分離度的影響

隨著乙腈體積分數(shù)的增加,三唑類手性農(nóng)藥的分離度逐漸降低,見圖5。一方面因為隨著乙腈體積分數(shù)的增大,乙腈分子會與溶質(zhì)分子相互競爭,從而占據(jù)環(huán)糊精的內(nèi)腔,使其包合能力減弱;另一方面可能是因為在反相作用機理下,乙腈體積分數(shù)增大,流動相的洗脫能力增強,溶質(zhì)和環(huán)糊精之間的作用時間減短,使得包合作用減弱,分離度降低?？紤]到繼續(xù)降低乙腈含量,流動相的洗脫能力會減弱,從而使得出峰時間延長,故不再繼續(xù)降低乙腈含量。選擇35%乙腈體積分數(shù)作為進一步優(yōu)化其他實驗條件的基礎。

圖 5 乙腈體積分數(shù)對3種對映體分離度和保留時間的影響Fig. 5 Effects of ACN volume percentage on resolution and retention time of the three enantiomers Column dimension: 10 cm (effective length)×100 μm; mobile phase: ACN-20 mmol/L phosphate buffer (pH=7.8) containing 20 mmol/L HP-γ-CD; applied voltage: -4 kV; UV detection wavelength: 220 nm; pump flow rate: 0.04 mL/min.

2.2.3施加電壓對手性分離的影響

pCEC模式下,遷移行為同時被壓力和電滲流驅(qū)動,當在毛細管的入口端接零極,出口端接負極,施加負電時,電滲流和壓力流方向一致,可以達到快速分離的效果。圖6為3種對映體在不同電壓下的分離色譜圖,當施加電壓為0 kV(cLC模式)時,出峰極慢;當施加-2 kV到-7 kV電壓時,分離時間顯著縮短,分離度先提高,隨后降低,在-6 kV時達到最大分離度(見表2)。施加電壓后,分離度和柱效一開始提高的原因是柱塞型電滲流驅(qū)動力逐步增強,而拋物線形壓力流驅(qū)動力逐漸降低。當施加壓力達-6 kV時,兩者達到最好的結(jié)合效果,分離度達到最大值;隨著電壓進一步增大,分離度下降,可能是由于樣品和手性添加劑的作用時間減少。

圖 6 施加電壓對3種對映體分離度的影響Fig. 6 Effects of applied voltage on resolutions 1. uniconazole; 2. diniconazole; 3. propiconazole. Column dimension: 10 cm (effective length)×100 μm; mobile phase: ACN-20 mmol/L phosphate buffer (pH=7.8) containing 20 mmol/L HP-γ-CD (35/65, v/v); applied voltage: 0 to -7 kV; UV detection wavelength: 220 nm; pump flow rate: 0.04 mL/min.

表 2 施加電壓對3種對映體分離度的影響Table 2 Effects of applied voltage on resolutions of the three enantiomers

2.2.4緩沖鹽濃度和pH對分離度的影響

緩沖鹽濃度和pH對分離效果的影響主要體現(xiàn)在對焦耳熱和分離度兩方面[23,24]的影響。本實驗選用磷酸鹽作為緩沖鹽體系,考察了鹽濃度及pH對分離度的影響。其中,磷酸鹽濃度在10～30 mmol/L時對分離度影響不大,但濃度越大,產(chǎn)生的焦耳熱也越大,而濃度太小又不利于電滲流的穩(wěn)定,考慮后續(xù)施加電壓的需要,將緩沖鹽濃度確定為20 mmol/L。

同樣,考察了磷酸鹽緩沖液的pH對分離度的影響。如圖7所示,與pH 7.8相比,pH為6.8時,烯效唑和烯唑醇的分離度顯著提高,pH對丙環(huán)唑的分離度影響不大。由于pH過低會抑制電滲流,不利于樣品的快速分離,綜合考慮,我們最終選擇pH 6.8作為3種對映體同時分離的最佳條件。

圖 7 pH對3種對映體分離度的影響Fig. 7 Effects of pH on resolutions 1. uniconazole 2. diniconazole 3. propiconazole. Column dimension: 10 cm (effective length)×100 μm; mobile phase: ACN-20 mmol/L phosphate buffer containing 20 mmol/L HP-γ-CD (35/65, v/v); applied voltage: -6 kV; UV detection wavelength: 220 nm; pump flow rate: 0.04 mL/min.

2.2.5條件優(yōu)化后的手性分離結(jié)果

當流動相pH調(diào)整為6.8時,3對對映體的分離度顯著增加,這時增加流動相中有機相的比例,提高施加電壓,可以在滿足分離度的情況下,縮短出峰時間,提高分析效率。

最終確定烯效唑、烯唑醇、丙環(huán)唑3種三唑類手性農(nóng)藥的最佳分離條件為:流動相為乙腈-20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8,含20 mmol/L HP-γ-CD)(45∶55, v/v);泵流速0.04 mL/min;施加電壓為-9.4 kV。在該條件下,在12 min內(nèi)實現(xiàn)了3種三唑類手性農(nóng)藥的同時拆分和分離,相鄰兩個峰之間的分離度達4.20、12.9、4.41、4.09、1.70,柱效高達310 000 plates/m,分離譜圖見圖8。

圖 8 3種手性物質(zhì)的分離色譜圖Fig. 8 Chromatogram of three enantiomers 1. uniconazole 2. diniconazole 3. propiconazole. Column dimension: 10 cm (effective length)×100 μm; mobile phase: ACN-20 mmol/L phosphate buffer (pH=6.8) containing 20 mmol/L HP-γ-CD (45/55, v/v); applied voltage: -9.4 kV; UV detection wavelength: 220 nm; pump flow rate: 0.04 mL/min.

3 結(jié)論

本工作通過優(yōu)化合成條件,在2 h內(nèi)制備出了單分散性良好的亞微米二氧化硅微球,經(jīng)C18修飾后填充于毛細管中,制備出粒度均勻的亞微米填充毛細管色譜柱。通過流動相添加劑的手性選擇作用在pCEC平臺上對手性三唑類農(nóng)藥進行同時拆分和分離研究。該研究實現(xiàn)了在12 min內(nèi)對烯效唑、烯唑醇和丙環(huán)唑的同時拆分和分離,相鄰兩個峰之間的分離度達4.20、12.9、4.41、4.09、1.70。該方法以pCEC為平臺,結(jié)合亞微米色譜柱的優(yōu)勢,為多種手性農(nóng)藥的同時分離研究提供了新的思路和方法,取得了較好的分離效果。

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