肖 漢, Kevin YAN, 鄭怡婷, 王 彥*, 閻 超*(. 上海交通大學(xué)藥學(xué)院, 上海 0040; . University of California, Riverside 95, USA)

維生素B2又稱(chēng)核黃素,是一種人體必需的水溶性維生素。在人體內(nèi)主要以?xún)煞N衍生物黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在,作為重要的氧化還原酶的輔基參與生物氧化反應(yīng)及糖、蛋白質(zhì)等的代謝[1]。核黃素不能在人體內(nèi)自合成,只能從食物和外源性補(bǔ)充劑中攝取,核黃素的缺乏將導(dǎo)致人和動(dòng)物能量代謝受阻,引起口角炎、舌炎、角膜血管增生等癥狀[2]。另外,維生素B2作為一種維生素類(lèi)藥,可用于輔助治療高血壓、冠心病等慢性病,也可用于治療放化療所引起皮炎、黏膜炎等[3]。

維生素B2因其結(jié)構(gòu)中含有異咯嗪環(huán),穩(wěn)定性較差,遇光容易分解[4],很多研究都對(duì)維生素B2的光降解特性進(jìn)行了研究,測(cè)定了不同光照條件下維生素B2的含量變化[5,6]。目前對(duì)于藥物穩(wěn)定性的研究,包括維生素B2的光穩(wěn)定性研究,通常是在固定離子強(qiáng)度的情況下進(jìn)行的。然而,一系列研究表明,離子強(qiáng)度對(duì)藥物穩(wěn)定性及光解反應(yīng)的速率有較大的影響[7-9]。由于液體制劑會(huì)加入等滲調(diào)節(jié)劑等鹽類(lèi)物質(zhì),因而在研究維生素B2的光解反應(yīng)時(shí),不應(yīng)僅僅考察在水溶液中的分解情況,在鹽溶液中的研究將有更實(shí)際的參考價(jià)值。考察維生素B2在不同離子強(qiáng)度條件下的光照穩(wěn)定性,首先需要建立維生素B2及降解產(chǎn)物的分析方法。目前,維生素B2多采用紫外-可見(jiàn)分光光度法、高效液相色譜法、熒光比色法等[3,10-12]。UV和HPLC的靈敏度欠佳,熒光分光光度法靈敏度高,但無(wú)法測(cè)定分解反應(yīng)產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)。

加壓毛細(xì)管電色譜(pressurized capillary electrochromatography, pCEC)是近年發(fā)展起來(lái)的一種新興電動(dòng)微分離技術(shù),它以?xún)?nèi)含色譜固定相的毛細(xì)管為分離柱,利用電滲流結(jié)合壓力流來(lái)推動(dòng)流動(dòng)相,既可分離帶電物質(zhì)也可分離中性物質(zhì)。具有高柱效、高選擇性、高分辨度、快速分離、樣品和試劑用量少的特點(diǎn)[13]。pCEC已廣泛應(yīng)用于藥物分析[14]、食品檢測(cè)[15]等領(lǐng)域。將具有高效分離能力的pCEC和高靈敏度的激光誘導(dǎo)熒光(laser-induced fluorescence, LIF)檢測(cè)器聯(lián)用[16],可顯著增加其對(duì)痕量物質(zhì)的分析,非常適合于維生素B2和其有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定[17]。

本研究將pCEC-LIF微分離平臺(tái)應(yīng)用于維生素B2及其熒光性分解產(chǎn)物的分離分析中,建立分析維生素B2及有關(guān)物質(zhì)的新方法,同時(shí)將利用此平臺(tái)考察維生素B2溶液光解反應(yīng)的速率與離子強(qiáng)度之間的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TriSep-2100型加壓毛細(xì)管電色譜儀(美國(guó)Unimicro Technologies公司),由激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(型號(hào)Trisep-3000)、溶劑輸送系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、高壓電源及數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)5部分組成;WD-A型藥物穩(wěn)定性檢查儀(天津新天光分析儀器技術(shù)公司); Sartorius BT224S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司); KQ5200DE超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司); Molcell 1805V摩爾細(xì)胞型純水機(jī)(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司); F7000熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)。

維生素B2(vitamin B2, VB2,批號(hào)K1622101,含量98%)購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司;光黃素(lumiflavin,含量95%)購(gòu)自加拿大Toronto Research Chemicals公司,磷酸氫二鈉(含量99%)購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA,含量98%)和氯化鈉(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇和乙腈(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Tedia公司。

1.2 溶液配制

維生素B2對(duì)照儲(chǔ)備液的配制:精密稱(chēng)取維生素B218.8 mg置于250 mL容量瓶中,準(zhǔn)確配制濃度為2.0×10-4mol/L的儲(chǔ)備液。

光黃素對(duì)照儲(chǔ)備液的配制:精密稱(chēng)取光黃素12.8 mg置于250 mL容量瓶中,準(zhǔn)確配制濃度為2.0×10-4mol/L的儲(chǔ)備液。

維生素B2系列對(duì)照溶液的配制:用超純水將上述對(duì)照儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋為0.25×10-4、0.50×10-4、1.0×10-4和1.5×10-4mol/L的系列對(duì)照溶液。

緩沖液和不同離子強(qiáng)度溶液的配制:配制10、20和40 mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS), pH為7.0,并加入氯化鈉分別調(diào)節(jié)其離子強(qiáng)度。

維生素B2/PBS的配制:將維生素B2溶于上述PBS緩沖液中,現(xiàn)用現(xiàn)配。

以上含維生素B2的溶液均用錫箔紙包裹,避光冷藏保存。

1.3 光解反應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件

吸取2 mL的維生素B2/水溶液和維生素B2/PBS置于透明玻璃樣品瓶中,放入藥物穩(wěn)定性檢查儀內(nèi),控制檢查儀的燈光強(qiáng)度為3 500 Lx,溫度保持在室溫,開(kāi)啟風(fēng)扇。開(kāi)始光照的時(shí)間記為t0,在光照不同時(shí)間點(diǎn)取樣,樣品避光冷藏保存。

1.4 維生素B2熒光光譜掃描實(shí)驗(yàn)條件

發(fā)射光譜測(cè)量模式,激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射光譜波長(zhǎng)測(cè)量范圍:450～600 nm,激發(fā)波長(zhǎng)狹縫寬度5 nm,發(fā)射波長(zhǎng)狹縫寬度5 nm,溫度為室溫。

1.5 pCEC-LIF實(shí)驗(yàn)條件

色譜柱:毛細(xì)管色譜柱(150 mm×100 μm, 1.8 μm, C18);流動(dòng)相A:水(含0.1%(v/v)三氟乙酸),流動(dòng)相B:乙腈(含0.1%(v/v)三氟乙酸),梯度洗脫(0 min, 30%B; 0-15 min, 30%B上升至90%B; 15-20 min, 90%B),總流速:0.05 mL/min;柱溫:室溫;分流比:1∶600;進(jìn)樣量:3 nL; LIF激發(fā)波長(zhǎng):488 nm,發(fā)射波長(zhǎng):520 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 維生素B2在不同離子強(qiáng)度溶液中的熒光光譜

維生素B2溶液為黃色,自身發(fā)黃綠色熒光,發(fā)生光解后,溶液顏色整體變淡,在離子強(qiáng)度大的溶液中褪色更加明顯。通過(guò)熒光分光光度計(jì)分別測(cè)量維生素B2在水和20 mmol/L PBS(離子強(qiáng)度為0.5 mol/L)中光照0.5、1、1.5和2 h后的熒光光譜,見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示,維生素B2/水溶液和維生素B2/PBS在光照不同時(shí)間后,熒光光譜形狀并沒(méi)有大的改變,但熒光強(qiáng)度發(fā)生了改變。維生素B2/水溶液在488 nm處激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度隨光照時(shí)間有一定程度的下降,但遠(yuǎn)低于其在PBS中的下降程度。由此說(shuō)明離子強(qiáng)度對(duì)維生素B2光解反應(yīng)有直接影響,溶液中離子強(qiáng)度的增加,將加快維生素B2光解反應(yīng)的速率。

圖 1 在不同光照時(shí)間下維生素B2熒光光譜的比較Fig. 1 Comparison of fluorescence spectra of vitamin B2 with different exposure time to light a. aqueous solution; b. phosphate buffer saline (PBS)solution.

在圖1中看到,維生素B2在水溶液和磷酸鹽溶液中的熒光強(qiáng)度有不同程度的下降,這個(gè)強(qiáng)度代表的是整個(gè)維生素B2反應(yīng)體系中的總熒光強(qiáng)度,即維生素B2和光降解產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度的總和,說(shuō)明維生素B2的光解產(chǎn)物整體上在488 nm激發(fā)時(shí)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度不如維生素B2本身,也可能是部分降解產(chǎn)物沒(méi)有熒光信號(hào)導(dǎo)致。為了進(jìn)一步研究維生素B2和光降解產(chǎn)物的變化,我們需要建立有分離能力的分析方法。

2.2 pCEC-LIF分析維生素B2及其分解產(chǎn)物

pCEC-LIF系統(tǒng)中,毛細(xì)管色譜柱的出口端連接負(fù)電極,進(jìn)口端接地,電滲流與壓力流方向一致。在毛細(xì)管色譜柱中,樣品根據(jù)各自的分配系數(shù)和電泳淌度的不同得到分離。將毛細(xì)管色譜柱的窗口直接安裝于可變波長(zhǎng)LIF中,激光器發(fā)射出的488 nm激光由激發(fā)濾光片濾光后經(jīng)二向色鏡反射,通過(guò)物鏡聚焦到色譜柱窗口上,激發(fā)被分離的待測(cè)物質(zhì)產(chǎn)生熒光,熒光通過(guò)物鏡聚焦、濾光片過(guò)濾,聚焦到光電倍增管(photomultiplier tube, PMT)前面狹縫處,由PMT采集轉(zhuǎn)化成電信號(hào),然后被信號(hào)采集單元轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)輸出。

實(shí)驗(yàn)中首先考察了流動(dòng)相梯度、施加電壓等對(duì)維生素B2分析的影響。其中電壓的影響如圖2所示?？煽闯?隨著電壓的增加,分離時(shí)間縮短。同時(shí),各個(gè)物質(zhì)仍能得到良好的分離,主峰維生素B2與右側(cè)相鄰雜質(zhì)峰的分離度也隨電壓的增加而增加。其主要原因在于,加壓毛細(xì)管電色譜兼具HPLC和電泳的雙重性質(zhì),可通過(guò)改變電壓來(lái)增加分離的選擇性。圖2中,由于毛細(xì)管中電滲流方向和外加電壓方向一致,隨電壓增加,維生素B2等物質(zhì)的保留時(shí)間縮短;同時(shí)由于分離對(duì)象所帶電荷不同,電壓對(duì)其電泳速度的影響不完全一樣,因而維生素B2與右側(cè)相鄰降解產(chǎn)物峰的分離度隨著電壓增加也有所增加,體現(xiàn)了加壓毛細(xì)管電色譜的雙重分離機(jī)理。

圖 2 電壓對(duì)pCEC-LIF分離維生素B2及其光解產(chǎn)物的影響Fig. 2 Effects of voltage on separation of vitamin B2 and its photolysis products by pressurized capillary electrochromatography-laser induced fluorescence (pCEC-LIF) detection Column dimension: 150 mm×100 μm, 1.8 μm, C18; mobile phase A: H2O, containing 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid(TFA), pH 2; mobile phase B: acetonitrile, containing 0.1% (v/v) TFA. Gradient elution: 0 min, 30%B; 0-15 min, 30%B to 90%B; 15-20 min, 90%B. LIF excitation wavelength: 488 nm; emission wavelength: 520 nm; pump flow rate: 0.05 mL/min.

在pCEC-LIF最優(yōu)條件下,維生素B2溶液的分離如圖3所示?？梢钥闯?維生素B2對(duì)照品(見(jiàn)圖3a)及光解產(chǎn)物光黃素對(duì)照品(見(jiàn)圖3b)均顯示一個(gè)單一的色譜峰。隨著光解反應(yīng)的進(jìn)行,維生素B2在水溶液(見(jiàn)圖3c)和PBS(見(jiàn)圖3d)中均開(kāi)始降解,并有新的降解產(chǎn)物產(chǎn)生,但降解峰的個(gè)數(shù)和強(qiáng)度有所不同。當(dāng)光照24 h后,維生素B2在水溶液(見(jiàn)圖3e)和鹽溶液(見(jiàn)圖3f)中的色譜峰基本消失,色譜圖中僅存在降解產(chǎn)物的峰。在最優(yōu)條件下,維生素B2的多種帶熒光的光解產(chǎn)物都得到了很好的分離,說(shuō)明我們建立的pCEC-LIF為維生素B2溶液的光降解產(chǎn)物研究提供了一個(gè)很好的分析平臺(tái)。

圖 3 維生素B2、光黃素及維生素B2在水溶液和PBS緩沖液中光解不同時(shí)間后的pCEC-LIF譜圖Fig. 3 pCEC-LIF electrochromatograms of vitamin B2, lumiflavin and photolysis products of vitamin B2 in aqueous solution and PBS with different exposure time to light (a) vitamin B2 reference standard; (b) lumiflavin reference standard; (c) vitamin B2 in aqueous solution and (d) PBS exposed to light for 2 h, and (e) in aqueous solution and (f) PBS exposed to light for 24 h. Applied voltage: -9 kV. Other conditions are the same to those in Fig. 2.

圖 4 維生素B2及光黃素的結(jié)構(gòu)式Fig. 4 Structure of vitamin B2 and lumiflavin

本研究使用的是反相色譜柱。而維生素B2的結(jié)構(gòu)如圖4a所示?？梢钥吹?在異咯嗪環(huán)的10號(hào)位N原子上所連接的基團(tuán)上有4個(gè)極性較大的羥基,在反相色譜中保留較弱。而降解產(chǎn)物光黃素如圖4b所示,在其他結(jié)構(gòu)基本不變的情況下,其10號(hào)位N原子上的基團(tuán)部分丟失,雖然相對(duì)分子質(zhì)量變小,但是極性大的羥基也脫去了,因而產(chǎn)物分子在相對(duì)分子質(zhì)量減小同時(shí),極性亦減小,保留增加,符合RPLC的保留規(guī)律。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性

在pCEC-LIF上分別測(cè)定1.2節(jié)所述維生素B2系列對(duì)照溶液,在該系列對(duì)照溶液的濃度范圍內(nèi),根據(jù)色譜圖上的峰面積Y對(duì)濃度X(mol/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程Y=877 201X-24 602(r>0.999),表明方法的線性關(guān)系良好。定量限可低至5×10-8mol/L。連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算得保留時(shí)間的RSD為2.1%,峰面積的RSD為3.7%。

2.4 維生素B2在不同離子強(qiáng)度溶液中的降解反應(yīng)

將維生素B2溶解在不同離子強(qiáng)度的PBS中,在光照不同時(shí)間后取樣,基于建好的pCEC-LIF平臺(tái)進(jìn)行分析。

考察了不同濃度的緩沖液中,維生素B2濃度隨光照時(shí)間的變化(見(jiàn)圖5)。隨著光照時(shí)間的增加,維生素B2在所有溶液中的濃度都會(huì)逐漸降低,但在水溶液中的降低程度最小,且緩沖溶液的濃度越大,維生素B2的降解越快。

圖 5 光照時(shí)間對(duì)水溶液和PBS中維生素B2濃度變化的影響Fig. 5 Effect of exposure time to light on the concen- tration change of vitamin B2 dissolved in aqueous solution and PBS

圖 6 光照1 h時(shí)不同PBS中維生素B2濃度的變化Fig. 6 Concentration changes of vitamin B2 in different PBS with 1-hour light exposure

2.5 維生素B2光解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究

維生素B2在水溶液中的光解遵從一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[10]。故根據(jù)動(dòng)力學(xué)方程,維生素B2初始濃度c0與時(shí)間t時(shí)的濃度ct有以下關(guān)系:

ln (c0/ct)=kt

(1)

其中k為表觀反應(yīng)速率常數(shù)。

表 1 不同PBS中維生素B2光解的kTable 1 Apparent rate constant of photolysis (k)of vitamin B2 in different PBS

按式(1),基于pCEC-LIF求得維生素B2在不同離子強(qiáng)度溶液中的k,如表1所示?？煽闯?磷酸鹽濃度越高,離子強(qiáng)度越大,維生素B2光解反應(yīng)的表觀反應(yīng)速率常數(shù)越大。

離子強(qiáng)度對(duì)溶液中化學(xué)反應(yīng)的影響又稱(chēng)原鹽效應(yīng)。在藥物制劑中,往往加入等滲調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、pH調(diào)節(jié)劑,而這些多為無(wú)機(jī)鹽[18],產(chǎn)生的離子強(qiáng)度可能會(huì)影響藥物的降解速度,影響的定量關(guān)系可由過(guò)渡態(tài)理論導(dǎo)出[19]。

離子強(qiáng)度對(duì)藥物降解速度的影響符合下式[20]:

(2)

式中,ZA、ZB是反應(yīng)物在溶液中所帶電荷,μ是離子強(qiáng)度,k0是無(wú)限稀釋下的反應(yīng)速率常數(shù)。式(2)適用于μ較小的體系,而在離子強(qiáng)度較大的溶液體系中,式(2)可表示為:

(3)

圖 7 不同濃度PBS時(shí)與log k的關(guān)系Fig. 7 Plot of versus log k with different concentrations of PBS

3 結(jié)論

本研究基于pCEC-LIF平臺(tái),建立了維生素B2及其熒光性分解產(chǎn)物的分析方法,實(shí)現(xiàn)了維生素B2及多種光降解產(chǎn)物的分析。用該聯(lián)用系統(tǒng)研究了維生素B2在水溶液和PBS中的光解反應(yīng)速率與離子強(qiáng)度之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)維生素B2溶液的光解速率與磷酸鹽濃度及離子強(qiáng)度呈正相關(guān)性,動(dòng)力學(xué)計(jì)算表明,該條件下的光解反應(yīng)是兩種帶同種電荷的離子之間的反應(yīng)。因而,在維生素B2液體制劑的運(yùn)輸、保存和使用過(guò)程中,應(yīng)注意控制體系的離子強(qiáng)度。

參考文獻(xiàn):

[1] Murataliev M B, Feyereisen R, Walker F A. Biochim Biophys Acta, 2004, 1698(1): 1

[2] Wang J Y, Zhu S G, Xu C F. Biochemistry. Beijing: Higher Education Press, 2008: 199

王鏡巖, 朱圣庚, 徐長(zhǎng)法. 生物化學(xué)教程. 北京: 高等教育出版社, 2008: 199

[3] Zhang H X, Huang R Q, Xiao B K, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2010, 30(1): 67

張紅霞, 黃榮清, 肖炳坤, 等. 藥物分析雜志, 2010, 30(1): 67

[4] Zhang W S, Li A L. Medicinal Chemistry. Beijing: Higher Education Press, 2004: 647

仉文升, 李安良. 藥物化學(xué). 北京: 高等教育出版社, 2004: 647

[5] Ahmad I, Fasihullah Q, Vaid F H M. J Photochem Photobiol B, 2004, 75(1): 13

[6] Pan D Y, Lan X M. Chinese Journal of Drug Administration and Clinical Medicine, 2010, 10(7): 779

潘代勇, 蘭小曼. 中國(guó)藥物與臨床, 2010, 10(7): 779

[7] Shang J, Chen J, Shen Z, et al. Environ Sci Pollut Res Int, 2015, 22(16): 12374

[8] Gong Y, Fu J, O’Reilly S E, et al. J Hazard Mater, 2015, 287: 142

[9] Zhou C, Chen J, Xie Q, et al. Chemosphere, 2015, 138: 792

[10] Zong Y, Zhang S G. Chinese Journal of Pharmaceutical Sciences, 2003, 38(4): 303

宗怡, 張石革. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2003, 38(4): 303

[11] Ahmad I, Anwar Z, Ali S A, et al. J Photochem Photobiol B, 2016, 157(3): 113

[12] Pharmacopoeia Commission of People’s Republic of China. Pharmacopoeia Commission of People’s Republic of China, Part 2. Beijing: China Medical Science Press, 2015: 1232

國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典, 二部. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015: 1232

[13] Wan Q Y, Ru X, Wang X X, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015, 43(7): 1063

萬(wàn)青云, 茹鑫, 王曉曦, 等. 分析化學(xué), 2015, 43(7): 1063

[14] Zheng S, Shi W J, Wang X X, et al. Food Science, 2014, 35(20): 105

鄭署, 施文君, 王曉曦, 等. 食品科學(xué), 2014, 35(20): 105

[15] Guo Q L, Shi H L, Zhao L, et al. Food Research and Development, 2015(8): 77

郭啟雷, 史海良, 趙麗, 等. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2015(8): 77

[16] Lu Q M, Zhang L, Cheng J T, et al. Chemistry, 2010, 73(7): 586

盧巧梅, 張?zhí)m, 程錦添, 等. 化學(xué)通報(bào), 2010, 73(7): 586

[17] Wu Y M, Wu Q Z, Wang X C, Chinese Journal of Chromatography, 2010, 28(3): 247

吳翊民, 吳慶政, 王曉春, 等. 色譜, 2010, 28(3): 247

[18] Gao P Y, Li J B. Physical Chemistry. Beijing: Science Press, 2007: 220

高丕英, 李江波. 物理化學(xué). 北京: 科學(xué)出版社, 2007: 220

[19] Cui F D. Pharmaceutics. Beijing: People’s Health Publishing House, 2012: 72

崔福德. 藥劑學(xué). 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2012: 72

[20] Liu J E. Pharmaceutical Preparation Technology. Beijing: Chemical Industry Press, 2008: 264

劉姣娥. 藥物制劑技術(shù). 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008: 264