錢英紅 ，徐博然 ，劉 博 ，曹金山 ，關(guān) 紅 ，毛 偉

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

細菌等病原微生物感染動物機體后會發(fā)生天然免疫過程。在這一過程中模式識別受體Toll樣受體 （Toll-like receptors，TLRs）發(fā)揮著重要的作用，病原分子能夠與其結(jié)合，激活相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可作為重要的紐帶將天然免疫和獲得性免疫聯(lián)系起來，進而在免疫性疾病的治療過程中產(chǎn)生重要的作用。TLRs能夠與包括細菌及其內(nèi)毒素等模式識別分子發(fā)生非特異性結(jié)合，激活的TLRs可促進細胞因子和炎癥介質(zhì)的合成分泌，同時還可使炎癥細胞發(fā)生浸潤，促使機體發(fā)生炎癥反應(yīng)。有文獻報道，TLR2和TLR4在機體抵御細菌感染引發(fā)炎癥反應(yīng)發(fā)生過程中具有關(guān)鍵的作用，其激活效應(yīng)如能得到有效的控制，可降低動物機體炎癥反應(yīng)發(fā)生的程度［1-2］。綜上所述，該研究擬以小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象，按照文獻中TLR2和TLR4的序列進行受體封閉肽的合成，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了TLR2和TLR4的特異性受體封閉肽對小鼠腹腔巨噬細胞腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA 表達的影響，探討TLR2和TLR4受體在細菌毒素脂多糖（Lipopoly-saccharides，LPS）刺激小鼠腹腔巨噬細胞過程中對TNF-α基因表達影響的作用機制。

表1 受體封閉肽合成序列

表2 試驗分組

1 材料

1.1 實驗動物

實驗動物選擇 6～8 周齡，體重 18～22 g，雌、雄各半的C57BL/6J小鼠，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 試驗試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司提供；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒由Roche公司提供；細菌脂多糖由美國Invitrogen公司提供；小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒由美國Biolegend公司提供；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

2 試驗方法

2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)

參照劉博［3］報道的方法進行小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)。

2.2 TLR2和TLR4受體封閉肽的合成

根據(jù)Toshchakov等［4］研究報道中TLR2和TLR4封閉小肽序列進行合成，序列見表1。TLR2和 TLR4 受體封閉肽、對照肽（control peptide，CP）均由吉爾生化公司合成。

2.3 分組及給藥

成功分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞后，按照2.5×106個/mL細胞濃度，加入到6孔細胞培養(yǎng)板中進行貼壁培養(yǎng)并給予相應(yīng)的藥物作用，試驗分組見表2。

2.4 TLR2和TLR4受體封閉肽對小鼠腹腔巨噬細胞細胞因子TNF-α mRNA表達的影響

2.4.1 引物設(shè)計與合成：根據(jù)GenBank中公布的小鼠TNF-α序列（NM 013693.2）設(shè)計引物序列，TNF-α上游引物序列為CTTCTCATTCCTGCTTGTG，TNF-α下游引物序列為 ACTTGGTG-GTTTGCTACG。以管家基因GAPDH為內(nèi)參照，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表3RT-PCR反應(yīng)體系

2.4.2 總RNA的提?。涸囼灧纸M如表2。TLR2和TLR4受體封閉肽預(yù)處理24 h后，加入LPS（濃度為100 ng/mL）刺激4 h，對各組細胞進行總RNA的提取。具體試驗方法按照總RNA制備試劑盒說明書進行。

2.4.3 cDNA的制備：按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的制備。樣本置于-20℃冰箱保存待用。

2.4.4 RT-PCR檢測細胞因子TNF-α mRNA的表達量：按照表3配制RT-PCR反應(yīng)體系。

按照如下反應(yīng)條件進行熒光定量PCR反應(yīng)：50 ℃，2 min，1 個循環(huán)；95 ℃，10 min，1 個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，共 38個循環(huán)。 Real-time PCR檢測數(shù)據(jù)采用2-△Ct（△Ct=目的基因Ct值－GAPDH Ct值）進行計算，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

3 結(jié)果

由圖1可知，TLR2和TLR4受體封閉肽作用組中TNF-α mRNA的相對表達量極顯著降低于LPS刺激組和 CP對照組（P＜0.01）；而 LPS刺激組中TNF-α mRNA的相對表達量與CP對照組相比較無顯著性差異（P＞0.05）。由此可說明，當(dāng)加入TLR2和TLR4受體封閉肽作用于小鼠腹腔巨噬細胞后，TNF-α基因的相對表達量降低。

圖1 小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α mRNA相對表達量

4 討論

在機體發(fā)生炎癥反應(yīng)的過程中，TLR2與TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮著最為重要的作用，當(dāng)其激活后所引起的信號級聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇的最主要原因。研究顯示，LPS主要是通過識別TLR2受體，進而激活其介導(dǎo)的信號通路引發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而隨后的研究還發(fā)現(xiàn)TLR4也是識別LPS并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要受體。當(dāng)LPS刺激細胞后可通過MyD88和TRIF依賴性途徑募集下游接頭分子，進而使NF-κB和MAPK信號通路激活，啟動炎癥相關(guān)基因的表達，促使細胞釋放TNF-α、IL-1β以及IL-8等細胞因子，同時導(dǎo)致趨化因子RANTES和抗炎性因子IL-10的表達量升高［5-7］。

封閉肽是指遵循模擬天然蛋白之間相互作用位點的氨基酸序列而合成的小肽，能夠與原蛋白的結(jié)合位點發(fā)生結(jié)合效應(yīng)，進而使原蛋白之間的特異性相互作用受到阻礙。大量的研究表明，封閉肽能夠抑制信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活，從而在疾病的治療過程中發(fā)揮重要的作用［8］。因此，該研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了TLR2和TLR4受體封閉肽對LPS誘導(dǎo)下小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α mRNA表達的影響。研究結(jié)果顯示，TLR2和TLR4受體封閉肽能夠抑制LPS誘導(dǎo)下小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α基因的表達。由此可知，TLR2和TLR4受體封閉肽能夠在LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應(yīng)發(fā)生的過程中對細胞因子的表達產(chǎn)生影響，為日后封閉肽在臨床上推廣使用提供了試驗支持，對未來聯(lián)合用藥以及新藥的研發(fā)具有一定的意義。

參考文獻：

［1］曹雪濤.免疫學(xué)前沿進展［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

［2］景志忠.TOLL樣受體與天然免疫［M］.蘭州：蘭州大學(xué)出版社，2012.

［3］劉博.小鼠巨噬細胞TLR2、TLR4及RP105在金黃色葡萄球菌感染中的天然免疫應(yīng)答機制［D］.長春：吉林大學(xué)，2013.

［4］TOSHCHAKOV V Y， FENTON M J， VOGEL S N.Cutting Edge：Differential inhibition of TLR signaling pathways by cell-permeable peptides representing BB loops of TLRs［J］.Journal of Immunology， 2007， 178（5）：2655-2660.

［5］NARAYANAN K B，PARK H H.Toll/interleukin-1 receptor （TIR） domain-mediated cellular signaling pathways［J］.Apoptosis，2015，20（2）：196-209.

［6］ROCK F L， HARDIMAN G， TIMANS J C， et al.A family ofhuman receptors structurally related to Drosophila Toll［J］.PNAS，1998，95（2）：588-593.

［7］JIMENEZ L A，THOMSON J，BROWN D，et al.PM10 particles activate NF-kappa B in alveolar epithelial cells［J］.American Journal of Respiratory&Critical Care Medicine，1999，159（3）：A27.

［8］VOGEL S N，F(xiàn)ENTON M.Toll-like receptor 4 signalling：new perspectives on a complex signaltransductionproblem［J］.BiochemicalSocietyTransactions，2003，31（3）：664-668.